自體脂肪來源的間充質干細胞復合脫細胞真皮基質修復兔關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、由于負重關節(jié)面由透明軟骨組成，軟骨細胞被細胞外基質包繞，幾乎沒有遷徙能力，不能聚集到創(chuàng)傷部位，因此，軟骨組織一旦發(fā)生損傷后自我修復能力十分有限。軟骨缺損常常引起關節(jié)疼痛及功能障礙甚至殘疾，臨床上缺乏有效的治療方法，從而促進了軟骨組織工程技術地快速發(fā)展。軟骨組織工程涉及種子細胞、支架材料及生長因子、信號分子和應力作用等環(huán)境方面的內容。其中種子細胞是影響組織工程學的重要因素。脂肪來源的間充質干細胞（adipose-derived mesen

2、chymal stem cells，ADMSCs）由于其強大的增殖和分化能力做為組織工程的種子細胞來源而備受關注。
　　 目的：
　　 1.探討脂肪來源的間充質干細胞分離和培養(yǎng)的可行性，為擴大和優(yōu)化軟骨組織工程種子細胞源提供實驗依據(jù)。
　　 2.自體脂肪來源的間充質干細胞與脫細胞真皮基質（acellular derma matrix，ADM）復合修復兔膝關節(jié)軟骨缺損，對修復組織進行組織學和組織病理學評分，評價修復

3、效果，為臨床應用組織工程學方法修復關節(jié)軟骨缺損提供理論依據(jù)和奠定實驗基礎。
　　 方法：
　　 選用健康新西蘭兔36只。剪碎的兔脂肪組織使用0.1％Ⅰ型膠原酶消化離心后獲得自體ADMSCs后進行體外培養(yǎng)。流式細胞儀檢測ADMSCs表面抗原CD44的表達情況。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取原代、第3代ADMSCs，采用細胞計數(shù)法測定細胞生長曲線。
　　 體外特定條件下誘導ADMSCs定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞及軟

4、骨細胞。ADMSCs成脂方向誘導組成為DMEM，10％FBS，異丁基甲基黃嘌呤（IBMX），200μmol/L地塞米松，10μg/ml胰島素，1μmol/L吲哚美辛。ADMSCs成骨方向誘導組成為DMEM，10％FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/mL抗壞血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油。ADMSCs成軟骨誘導組成包括10％FBS、高糖DMEM、10μg/L轉化生長因子β1、50μg/ml抗壞血酸、6.25 mg/L胰島素。

5、ADMSCs成脂誘導分化后用油紅O染色，成骨方向誘導分化后用鈷鈣法堿性磷酸酶染色及茜素紅鈣結節(jié)染色，成軟骨方向誘導分化后進行Ⅱ型膠原免疫組化染色。使用特殊染色來證明ADMSCs的多向分化潛能。
　　 用小牛真皮制備ADM作為細胞載體，ADMSCs體外培養(yǎng)至第3代，制成濃度為5×105/ml的軟骨細胞懸液。將自體ADMSCs與ADM體外復合培養(yǎng)2d后，行掃描電鏡觀察后，移植于兔膝關節(jié)軟骨缺損處。
　　 將36只新西蘭兔隨機

6、分為ADMSCs/ADM實驗組、ADM對照組和空白對照組。實驗組髁間窩軟骨缺損處植入ADMSCs/ADM，ADM對照組單純植入脫細胞真皮基質，空白對照組不作任何植入，分別于術后6周、9周和12周每組各處死4只動物，取材對修復組織進行大體、組織學及免疫組化染色觀察，根據(jù)關節(jié)軟骨組織學評分及組織病理學評分標準對修復組織進行評分，數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0軟件，用隨機分組的SNK-q法進行統(tǒng)計分析，比較各組的評分差異是否具有統(tǒng)計學意義。

7、>　　 結果：
　　 1.接種24h后可見兔ADMSCs呈長梭形或多邊形貼壁。細胞增殖迅速，原代培養(yǎng)約10～14d左右可以達到80-90％融合。
　　 2.ADMSCs表面抗原的鑒定：流式細胞儀檢測結果顯示細胞表面抗原CD44呈陽性表達。
　　 3.ADMSCs生長曲線呈“S”形。貼壁2 d后細胞開始增殖，7d進入增殖高峰期，9 d后進入平臺期。
　　 4.ADMSCs成脂誘導分化后經(jīng)油紅染色顯示分泌紅

8、色脂滴的脂肪細胞：成骨誘導分化后堿性磷酸酶染色呈黑色沉淀，茜素紅染色呈鈣化結節(jié)；成軟骨誘導分化后Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性。
　　 5.電鏡下可見ADM呈多孔疏松結構，孔隙率較好，適合ADMSCs生長。
　　 6.術后9周ADMSCs/ADM實驗組大體觀察修復組織整合較好，無支架材料殘留。ADM對照組和空白對照組為纖維性修復和無修復。組織學評分ADMSCs/ADM實驗組與ADM對照組和空白對照組差別有顯著性意義（P<0.0

9、5），ADM對照組與空白對照組差別無顯著性意義（P>0.05）；組織病理學評分顯示ADMSCs/ADM實驗組與ADM對照組和空白對照組差別有顯著性（P<0.05），ADM對照組與空白對照組無顯著性差異（P>0.05）。
　　 7.術后12周ADMSCs/ADM實驗組大體觀察修復組織表面光滑，與周圍軟骨整合良好。ADM對照組和空白對照組為纖維性修復和無修復。組織學評分ADMSCs/ADM實驗組與.ADM對照組和空白對照組差別有顯著

10、性（P<0.05），ADM對照組與空白對照組差別有顯著性（P<0.05）；組織病理學評分顯示ADMSCs/ADM實驗組與ADM對照組和空白對照組差別有顯著性（P<0.05），ADM對照組與空白組差別有顯著性（P<0.05）。
　　 8.Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示ADMSCs/ADM實驗組修復區(qū)的軟骨細胞含Ⅱ型膠原，與周圍軟骨結合良好。
　　 結論：
　　 1.兔脂肪來源的間充質干細胞在體外具有生長穩(wěn)定，增殖較快的