脂肪來源干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒修復(fù)聲帶急性損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分是聲帶正常振動的基礎(chǔ)，其損傷后固有層細(xì)胞外基質(zhì)的組成及分布發(fā)生變化，大量纖維組織增生，形成聲帶瘢痕，導(dǎo)致發(fā)音障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床上，聲帶注射填充術(shù)在一定程度上能改善發(fā)音，但不能恢復(fù)聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)的組成及分布，也就不能實(shí)現(xiàn)聲帶的結(jié)構(gòu)重建、功能恢復(fù)。近年來，組織工程技術(shù)的發(fā)展給聲帶損傷的修復(fù)重建帶來了希望。種子細(xì)胞和支架材料的選擇是目前研究的核心內(nèi)容，可能對促進(jìn)聲帶損傷修復(fù)及功能恢復(fù)具有重大意義。

2、應(yīng)用胚胎干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞混合膠原注入受損的聲帶的研究取得了一定的進(jìn)展，但存在倫理限制、細(xì)胞來源少及創(chuàng)傷大等問題，且膠原在聲帶內(nèi)易被吸收。脂肪來源干細(xì)胞(ASCs)體外易分離培養(yǎng)，來源豐富，取材簡便，創(chuàng)傷小。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)是天然生物材料，在體內(nèi)可完全降解，對細(xì)胞和組織無毒性，是良好的細(xì)胞支架材料。
　　本實(shí)驗(yàn)將兔脂肪來源干細(xì)胞與牛脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒復(fù)合培養(yǎng)后注入急性損傷的兔聲帶，觀察其對損傷聲帶的修復(fù)重建效果。
　

3、　1、目的：
　　探討rASCs-MADM復(fù)合體用于聲帶注射的可行性及其對聲帶急性損傷的修復(fù)重建效果。
　　2、方法
　　2.1、取兔腹股溝脂肪組織，膠原酶消化，分離培養(yǎng)rASCs，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測細(xì)胞生長規(guī)律，定向誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定細(xì)胞的多向分化潛能，并對細(xì)胞進(jìn)行凍存復(fù)蘇培養(yǎng)。
　　2.2、無疫新鮮胎牛皮膚，機(jī)械方法去除表皮及真皮乳頭層，使用網(wǎng)狀層真皮，結(jié)合胰蛋白酶消化法-NaOH消蝕法-凍融法

4、，制成脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，將其切割成微粒，直徑約200-450μm。取DiI標(biāo)記好的rASCs與制備好的MADM復(fù)合培養(yǎng)，熒光顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附材料情況，MTS比色法檢測rASCs復(fù)合MADM后細(xì)胞增殖情況。復(fù)合體培養(yǎng)3天，與適量膠原混合后注入正常兔聲帶肌內(nèi)，術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶大體形態(tài)，并分別隨即取材，冰凍切片后立即在熒光顯微鏡下觀察rASCs在聲帶中存活、分布情況，HE染色觀察聲帶組織對材料的炎癥排斥反應(yīng)及材料降解

5、情況。
　　2.3、成年雄性新西蘭大白兔6只，體重2.7-3.2kg，隨機(jī)分為2組。麻醉后行喉裂開暴露雙側(cè)聲帶，半導(dǎo)體激光(功率8W)損傷雙側(cè)聲帶膜部后1/2組織，深達(dá)甲杓肌，術(shù)后2、4w內(nèi)窺鏡下觀察兔子雙側(cè)聲帶的大體形態(tài)，并隨即分別取材，HE染色觀察聲帶上皮覆蓋損傷部位及固有層組織結(jié)構(gòu)變化情況，VanGieson染色觀察固有層膠原排列變化。
　　2.4、新西蘭大白兔18只，體重約2.7-3.2kg，隨機(jī)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，每

6、組6只。Ⅰ組左聲帶注射rASCs-MADM，Ⅱ組左聲帶注射rASCs，Ⅲ組左聲帶注射MADM，各組右聲帶僅單純損傷，另設(shè)3只兔子的聲帶為正常對照。聲帶急性損傷，隨即進(jìn)行聲帶注射。聲帶注射術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶損傷修復(fù)情況，并于術(shù)后8w取材，HE染色觀察聲帶固有層組織結(jié)構(gòu)大體變化，VanGieson染色法觀察各組聲帶固有層膠原情況。
　　3、結(jié)果
　　3.1、rASCs體外易分離培養(yǎng)，取材料簡便，增殖能力強(qiáng)，在不同微

7、環(huán)境下可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞，凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞仍能保持良好增殖能力。
　　3.2、MADM所含膠原連續(xù)性好，相互交織成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙約20-50μm，可切割成直徑200-450μm微粒，可行注射方式移植。rASCs能黏附材料上生長良好并不斷增殖，與常規(guī)培養(yǎng)組細(xì)胞增殖能力比較，有顯著差異。rASCs-MADM在兔聲帶內(nèi)的免疫排斥反應(yīng)輕微，注入8w后，可觀察到有植入細(xì)胞存活和部分材料保留，說明材料生物相容性好，降解速

8、度適當(dāng)，是一種良好的支架材料。
　　3.3、喉裂開方式進(jìn)行聲帶損傷來建立聲帶急性損傷模型，損傷部位及程度明確，術(shù)后聲帶無明顯粘連，對動物頸部損傷不大，頸部無局部并發(fā)癥發(fā)生，整個操作程度簡單。切片發(fā)現(xiàn)：2w聲帶粘膜上皮已覆蓋損傷部位，固有層大量膠原沉積，未形成束狀，4w聲帶損傷部位不平整，固有層膠原沉積增生繼續(xù)增多，呈粗大束狀，排列紊亂。
　　3.4、聲帶急性損傷后即行聲帶注射，并于術(shù)后2、4、8w內(nèi)窺鏡下觀察聲帶大體情況，結(jié)

9、果顯示：注射rASCs-MADM組、rASCs組的聲帶損傷部位光滑，肉芽組織形成少，而注射MADM組聲帶、單純損傷組聲帶損傷部位表面不規(guī)則、肉芽組織形成多。HE染色、VanGieson染色法顯示，注射rASCs-MADM組、rASCs組聲帶固有層膠原排列連續(xù)有序，而注射MADM組膠原呈彎曲束狀緊密排列，單純損傷組膠原排列紊亂、斷裂，膠原大量沉積增生。
　　4、小結(jié)
　　4.1、rASCs來源豐富，取材簡便，體外易分離培養(yǎng)，增

10、殖能力強(qiáng)，能多向分化，應(yīng)用前景廣。
　　4.2、MADM制備簡便，強(qiáng)度適中，具有良好的三維結(jié)構(gòu)，生物相容性好,降解速度適當(dāng)，是良好的細(xì)胞支架材料和聲帶注射填充材料。
　　4.3、通過喉裂開對動物聲帶損傷來建立聲帶損傷動物模型方法可行，對動物損傷不大，操作簡單。
　　4.4、rASCs能粘附MADM表面生長，而且MADM能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，形成rASCs-MADM復(fù)合體，可行聲帶內(nèi)注射。聲帶注入rASCs-MADM復(fù)合體