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文檔簡介
1、深度缺損創(chuàng)面的修復(fù)在燒燙傷、難治性皮膚潰瘍、瘢痕整形等的治療中有著重要意義。傳統(tǒng)的治療方法主要是移植自體皮或自體皮瓣,常常會(huì)出現(xiàn)供皮區(qū)色素沉積,瘢痕形成。當(dāng)皮膚缺損面積較大時(shí),自體皮還會(huì)供應(yīng)不足。皮膚組織工程(TE)的發(fā)展與應(yīng)用為改善創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量,解決皮源短缺問題,提供了一條嶄新的途徑。
近年來,脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)成為組織工程皮膚研究中最有前景的真皮支架材料之一,ADM修復(fù)皮膚粘膜缺損和進(jìn)行軟組織充填的有效性已經(jīng)被動(dòng)物實(shí)
2、驗(yàn)和初期臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)所證明,是一種較為理想的真皮替代物。由于同種異體ADM來源有限且受倫理限制,為此研究人員開發(fā)了豬的ADM。傳統(tǒng)方法制備的異種ADM,抗原性明顯強(qiáng)于同種異體ADM,移植后成活率降低且收縮明顯,組織學(xué)研究證實(shí)組織中有廣泛的炎癥反應(yīng)及膠原結(jié)構(gòu)破壞。目前,異種ADM的制備方法還缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),主要有高滲鹽水法、酶消化法、戊二醛交聯(lián)法、去垢劑法、NaOH消蝕法、凍融法等。每種方法單獨(dú)使用時(shí)都不能保證既充分去除所有的細(xì)胞和細(xì)胞碎片
3、,又保證真皮結(jié)構(gòu)完整,必須與其他方法聯(lián)合應(yīng)用方能獲得較理想的ADM支架材料。另一方面,ADM移植后的血管化及營養(yǎng)成分滲透等問題的解決,對(duì)提高ADM支架的實(shí)用性有著重要的臨床意義。
本課題在現(xiàn)有ADM制備方法的基礎(chǔ)上,制備一種新型異種ADM微粒,并利用成纖維細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和生長因子的特性,將成纖維細(xì)胞種植于異種ADM微粒上,探索構(gòu)建ADM微粒皮膚的可行性;并將ADM微粒皮膚注射到SD大鼠皮下和移植到全層損傷
4、模型,觀察ADM微粒皮膚對(duì)軟組織和創(chuàng)傷的修復(fù)能力,期望能夠收獲一種應(yīng)用方便,適用范圍廣的組織工程微粒皮膚產(chǎn)品,并為規(guī)?;⑸唐坊a(chǎn)微粒皮膚奠定一個(gè)良好的基礎(chǔ)。
本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
1.改良消蝕法制備異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒及其生物相容性評(píng)價(jià)
應(yīng)用機(jī)械法切除豬真皮乳頭層,結(jié)合胰酶消化、NaOH消蝕法和凍融法除去網(wǎng)狀真皮中的所有細(xì)胞,制備成ADM。將ADM切割成顆粒狀,對(duì)ADM微粒做細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞
5、相容性實(shí)驗(yàn)、皮下埋藏實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其生物相容性。結(jié)果顯示ADM微粒大小較均勻呈瓷白色,有彈性,韌性好,質(zhì)地柔軟;三維結(jié)構(gòu)完整,膠原纖維稍松散但排列規(guī)則,相互交織成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔隙較多并均勻;成纖維細(xì)胞在ADM微粒上生長較好,在材料上有數(shù)層細(xì)胞生長;無明顯排異反應(yīng),組織相容性良好,血管和成纖維細(xì)胞長入快。
2.異種ADM微粒皮膚的構(gòu)建及其性能研究
體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞,用PKH26標(biāo)記,將細(xì)胞與ADM微粒復(fù)合
6、構(gòu)建微粒皮膚,用熒光顯微鏡觀察、電鏡觀察和MTT法檢測(cè)組織工程微粒皮膚的性能。結(jié)果顯示,種植第2天,成纖維細(xì)胞在ADM微粒上能夠較好黏附,但增殖緩慢,之后細(xì)胞增殖明顯加快,10天時(shí)達(dá)到增殖高峰。成纖維細(xì)胞能在ADM微粒上很好的生長,構(gòu)建好的組織工程微粒皮膚上成纖維細(xì)胞呈多層生長,并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。
3.異種ADM微粒皮膚皮下注射和SD大鼠全層皮膚損傷移植實(shí)驗(yàn)
將帶熒光的豬ADM微粒皮膚,注射到SD大鼠皮下,用熒光
7、顯微鏡和HE觀察ADM微粒真皮對(duì)皮下組織的修復(fù);將SD大鼠隨機(jī)分成3組,分別移植自體全厚皮膚、ADM微粒和ADM微粒皮皮膚。大體、熒光顯微鏡和HE觀察傷口愈合情況、計(jì)算創(chuàng)面愈合時(shí)間和收縮率。結(jié)果顯示ADM微粒皮下注射后一周可觀察到紅色熒光,提示種植的成纖維細(xì)胞具有活性。皮下注射ADM微粒皮膚8周時(shí)體積穩(wěn)定,膠原排列整齊,成纖維細(xì)胞數(shù)目少并穩(wěn)定,而單純ADM微粒皮下注射12周時(shí)體積才穩(wěn)定。皮膚移植修復(fù)全層皮膚損傷模型見:ADM微粒皮膚移植
8、和ADM微粒移植相比,血管化加快,特別是移植早期;ADM微粒皮膚對(duì)創(chuàng)面的修復(fù),其愈合時(shí)間與自體全厚皮膚移植相當(dāng)(P﹥0.05),明顯好于單純ADM微粒移植(P﹤0.01);創(chuàng)面收縮情況,ADM微粒皮膚與自體全厚皮膚移植相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05),與ADM微粒移植相比,差異顯著(P﹤0.01)。
綜上所述,我們所制備的豬ADM微粒是一種新型、免疫原性低、生物相容性好的真皮支架材料,用于構(gòu)建微粒皮膚具有實(shí)際可行性。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)
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