PDLSC細胞膜片-PRF-JBMSC細胞膜片復(fù)合結(jié)構(gòu)用于牙周復(fù)合體再生的研究.pdf

1、【背景】
　　牙周疾病是牙周支持組織的慢性炎性疾病，其主要癥狀為漸進性的牙周附著喪失和的牙槽骨吸收，最終表現(xiàn)為牙齒的松動、脫落[1]。菌斑控制是整個牙周病治療的基礎(chǔ)，但目前的治療手段僅能控制炎癥的進一步發(fā)展，不能徹底治愈。牙撕脫性損傷是指牙齒受到外力撞擊后由牙槽窩中脫出、同時牙周膜和牙髓被徹底撕脫的一類損傷，它是牙外傷中發(fā)生率較高的一類疾病，其治療難度大且預(yù)后很不穩(wěn)定。牙齒缺失又是人類常見的一類疾病，常由牙周病、齲齒、牙創(chuàng)傷等引起

2、[2]。其治療手段一般為可摘、固定義齒修復(fù)以及種植義齒修復(fù)。但可摘、固定義齒修復(fù)需要牙齒磨切，造成了二次損傷，且修復(fù)效果有限；而種植義齒修復(fù)雖然避免了牙齒磨切，但需要建立種植體與牙槽骨的骨性結(jié)合，缺乏天然牙周膜的封閉、支持、緩沖以及感知功能，故存在因合力過大或牙周感染導(dǎo)致骨吸收的風(fēng)險，因此重建具有功能性牙周膜的組織工程牙根仍是口腔科學(xué)研究的目標(biāo)之一[3,4]。
　　如上所述，牙周病治療，牙再植以及組織工程牙根的構(gòu)建，均涉及由牙周膜

3、、牙槽骨和牙骨質(zhì)組成的牙周復(fù)合體(Periodontal complex)的重建。牙周復(fù)合體是由多種不同組織共同構(gòu)成的一個良好的能夠緩沖咬合應(yīng)力的功能系統(tǒng)。牙周重建，涉及到牙根表面與牙槽骨硬骨板之間牙骨質(zhì)、牙周膜和部分牙槽骨的重建；功能性的牙周膜愈合應(yīng)該建立起牙周膜與牙骨質(zhì)、牙槽骨之間的沙比纖維交聯(lián)。如今，隨著組織工程學(xué)的發(fā)展及牙周再生技術(shù)的進步，采用干細胞以及合適的生物材料重建牙周組織成為當(dāng)下口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。
　　牙周重

4、建所涉及的種子細胞一般包括：牙周膜干細胞、牙囊細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等。大量的文獻報道證實，不同來源的干細胞雖然在體外誘導(dǎo)過程中仍顯示出向多種組織分化的能力，但其各自的分化能力仍存在差異，且保留了向獲取源組織分化的傾向性。如施松濤等[5]發(fā)現(xiàn)牙周膜細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞存在分化差異，與 HA復(fù)合移植裸鼠皮下8周后發(fā)現(xiàn)，前者更易分化為牙骨質(zhì)、牙周膜樣組織，而后者基本為骨樣組織。本研究依據(jù)多能細胞分化傾向性的不同，不同于以往經(jīng)常采用單種種子

5、細胞進行牙周重建，擬采用具有不同分化傾向性的種子細胞即牙周膜干細胞( PDL stem cells(PDLSCs))和骨髓間充質(zhì)干細胞(jaw bone MSCs(JBMSCs))，以實現(xiàn)牙周復(fù)合體的重建。
　　一般情況下，利用組織工程方法進行牙周再生，除細胞外還需要支架材料以及多種生長因子的參與，形成一種具有復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的合適的微環(huán)境，以促進種子細胞的粘附、增殖以及分化功能。細胞膜片技術(shù)（cell sheet engineeri

6、ng）是將種子細胞在一定條件下進行連續(xù)培養(yǎng)，誘使其形成多層細胞，同時使種子細胞在短時間內(nèi)形成大量細胞外基質(zhì)的技術(shù)。其中豐富的細胞外基質(zhì)成分大大提高了種子細胞定向植入的成功率，又可以最大限度的發(fā)揮干細胞的生物學(xué)功能。此外，細胞膜片中豐富的膠原基質(zhì)可以視為一種自源性的支架材料，其結(jié)構(gòu)內(nèi)富含大量的結(jié)構(gòu)蛋白和特殊蛋白為種子細胞發(fā)育提供了良好的微環(huán)境[6]。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin， PRF）是通過新鮮自體血一次

7、性離心制備而成富含血小板的膠凍狀物，壓成膜后形成一種富含各種生長因子的纖維蛋白支架結(jié)構(gòu)，其中各種生長因子間具有天然的配比，其含量一般為全血3-8倍，目前已經(jīng)安全應(yīng)用于臨床[7]。
　　本研究以牙周膜干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞的來源，以兩種細胞膜片中富含的細胞外基質(zhì)以及PRF中豐富的纖維蛋白作為支架材料的來源，以PRF中緩釋的具有天然配比的自體生長因子作為生長因子的來源，構(gòu)建了PDLSC sheet/PRF/JBMSC s

8、heet復(fù)合體結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)牙周復(fù)合體的再生。為了驗證以上的假說，我們首先在細胞層面、細胞膜片層片比較了這兩種干細胞的不同分化傾向性，然后鑒定PRF中主要生長因子的緩釋特性以及其對兩種干細胞增殖、分化的影響，最后我們制備了裸鼠異位移植模型加以驗證。通過制備表面脫礦的根形牙本質(zhì)支架（treated dentin matrix(TDM)）來模擬牙根界面的形態(tài)和微環(huán)境，制備由HA/TCP（hydroxyapatite(HA)/tricalcium

9、 phosphate(TCP)）構(gòu)成的根形支架來模擬牙槽骨界面的形態(tài)和微環(huán)境，將TDM插入根形的HA/ TCP支架后，兩者之間形成1mm左右的間隙，模擬牙周缺損間隙。然后我們將PDLSC sheet/PRF/JBMSC sheet復(fù)合體結(jié)構(gòu)移植入模擬的牙周缺損間隙，然后整體移植入裸鼠背部皮下，實驗8w后取材，檢測組織再生的情況?？紤]到牙周復(fù)合體是一種包含多種組織的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，PDLSC細胞膜片/PRF/JBMSC細胞膜片復(fù)合設(shè)計或許可以

10、為牙周復(fù)合體的再生提供一種新的、適合的方案。
　　本課題的研究內(nèi)容如下：
　　第一部分人牙周膜干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與鑒定
　　【目的】
　　對人的PDLSCs和JBMSCs進行體外分離、培養(yǎng)和鑒定，并在細胞層面分析兩種干細胞的不同特性。
　　【方法】
　　采用組織塊聯(lián)合酶消化法分離培養(yǎng)來自前磨牙根中段1/3的PDLSCs，采用沖洗法培養(yǎng)來自頜骨骨髓中的JBMSCs。將兩種細胞同時進行如下檢測

11、：干細胞表面標(biāo)志物檢測（STRO-1、CD29、CD146、CD23和CD45）；通過克隆形成實驗檢測其克隆形成能力；采用CCK-8法檢測7d內(nèi)細胞增殖曲線；通過體外成脂、成骨誘導(dǎo)分化，檢測其分化特性；分別與 HA/TCP顆粒混合后進行裸鼠皮下移植，檢測其異位成骨能力；采用Real-time PCR法檢測P2代的兩種干細胞的基因表達差異。
　　【結(jié)果】
　　PDLSCs表達更高的CD146陽性標(biāo)志物，其余標(biāo)志物的表達未見明顯

12、統(tǒng)計學(xué)差異；PDLSCs具有更強的克隆形成能力以及增殖能力；JBMSCs具有更好的體外誘導(dǎo)成脂、成骨能力。異位移植實驗結(jié)果表明：PDLSCs組等效骨密度值為430.4 mg/cc,而JBMSCs組等效骨密度值為615.8 mg/cc，兩者相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。H&E染色結(jié)果顯示：PDLSCs組新生組織為大量的牙周膜樣組織以及少量的牙骨質(zhì)樣組織；而JBMSCs組新生組織為大量的骨樣組織以及少量的纖維樣組織。Real-ti

13、me PCR檢測結(jié)果表明：JBMSCs表達水平較高具有統(tǒng)計學(xué)差異的基因包括：與細胞干性相關(guān)的基因(nanog)，與細胞粘附相關(guān)的基因(纖維粘連蛋白fibronectin、層粘連蛋白laminnin),以及成骨相關(guān)的基因(I型膠原col-I、III型膠原 col-III、骨膜蛋白periostin、骨涎蛋白bsp、骨橋蛋白opn和runx2)；PDLSCs表達水平較高的基因為牙骨質(zhì)形態(tài)蛋白（cemp-1）基因；在表達水平上無明顯的統(tǒng)計學(xué)差

14、異的基因包括細胞干性相關(guān)基因notch-1和牙骨質(zhì)附著蛋白(cap)基因。
　　【結(jié)論】
　?。?）成功地分離人的PDLSCs和JBMSCs；PDLSCs表達更高的細胞表面陽性標(biāo)志物CD146；與JBMSCs相比，PDLSCs具有更強的克隆形成能力以及增殖能力。
　?。?）與PDLSCs相比，JBMSCs表現(xiàn)出更強的體外成脂、成骨分化能力；異位移植實驗證實PDLSCs傾向于在體內(nèi)分化為牙骨質(zhì)-牙周膜樣組織，而JBMSC

15、s傾向于分化為骨樣組織。
　　（3）P2代的PDLSCs的基因表達與JBMSCs有明顯差異。原始基因的表達差異可能導(dǎo)致了兩種干細胞不同的增殖、分化能力。
　　第二部分：人骨髓基質(zhì)干細胞與牙周膜干細胞膜片的制備與鑒定
　　【目的】
　　利用富含Vc的膜片誘導(dǎo)液誘導(dǎo)人PDLSC sheet和JBMSC sheet，并在細胞膜片層面分析兩種干細胞膜片不同特性。
　　【方法】
　　配置含有50μg/mLVc的

16、膜片誘導(dǎo)液，將人的PDLSCs和JBMSCs連續(xù)誘導(dǎo)14 d后形成PDLSC sheet、JBMSCsheet，通過倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡觀察其表面形貌；通過H&E、免疫組化染色對其細胞外基質(zhì)進行鑒定；通過Real-time PCR、Western blot技術(shù)手段檢測膜片中相關(guān)基因、蛋白的表達情況。
　　【結(jié)果】
　　成功制備人的PDLSC sheet和JBMSCsheet；同一時間段（14 d）誘導(dǎo)的PDLSC sh

17、eet包含較多的細胞層（3-7層），分泌更多的細胞外基質(zhì)，膜片較厚；JBMSC sheet包含較少的細胞層(2-4層)。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：與PDLSCs（P2代）相比, PDLSCsheet表現(xiàn)出以下基因的高水平表達：牙周膜組織相關(guān)基因(col-I、col-III和periostin)，成骨相關(guān)的基因(runx2、bsp、opn和ocn)和成牙骨質(zhì)相關(guān)基因cemp-1,以及細胞粘附相關(guān)基因(fibrinectin和

18、laminnin)。與JBMSCs（P2代）相比,JBMSC sheet表現(xiàn)出以下基因的高水平表達：礦化相關(guān)的基因(runx2、 bsp、opn和ocn)，牙周膜組織相關(guān)基因(col-I和col-III)的表達，以及細胞粘附相關(guān)基因(fibrinectin和laminnin)。此外,通過Western-blot技術(shù)比較了PDLSC膜片和JBMSC膜片的相對蛋白表達，該結(jié)果與Real-time PCR的結(jié)果基本一致?？傮w來說，與礦化相關(guān)的

19、蛋白(COL-III、OPN和OCN)在JBMSC膜片組呈明顯的上升表達趨勢，而COL-I和CAP蛋白的表達水平在兩種細胞膜片中無明顯差異。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，PDLSC和 JBMSC兩種細胞膜片均強陽性表達 COL-I和 Fibronectin，均未見顯著性差異；ALP在JBMSC sheet的表達量稍強于PDLSC sheet。
　　【結(jié)論】
　?。?）成功制備人的PDLSC sheet和JBMSC sheet；與

20、JBMSC sheet相比，PDLSC sheet成膜片速度更快，同期內(nèi)分泌更多的細胞外基質(zhì)。
　?。?）Real-time PCR結(jié)果證實，兩種干細胞被誘導(dǎo)成細胞膜片后相關(guān)基因的表達發(fā)生了巨大的變化，在本實驗中，幾乎所有的檢測基因表現(xiàn)出上調(diào)的表達趨勢。例如，分別與P2代干細胞相比，PDLSC sheet和JBMSC sheet均表現(xiàn)出牙周組織特異性基因（col-I和col-III），礦化相關(guān)基因（runx2，bsp，opn和oc

21、n）以及細胞粘附相關(guān)基因（fibrinectin和laminnin）的上調(diào)表達。該實驗結(jié)果說明，在目的基因表達的層面上，對于牙周復(fù)合體的再生，細胞膜片相較于離散的細胞更有優(yōu)勢。
　?。?）Real-time PCR以及Western-blot結(jié)果證實，PDLSCsheet和JBMSCsheet之間的基因表達差異較大：JBMSC sheet表現(xiàn)出礦化相關(guān)基因（opn和ocn），粘附相關(guān)基因（fibrinectin和laminnin）

22、，以及col-III和periostin的上調(diào)表達；但cemp-1表達水平較PDLSC sheet低；兩種膜片間col-I和cap的表達未見明顯差異。該結(jié)果表明，PDLSCs和JBMSCs之間的基因表達差異從細胞層面持續(xù)到細胞膜片層面，而且這種基因以及蛋白表達的差異將最終影響到再生組織的結(jié)構(gòu)和功能。
　　第三部分釉基質(zhì)蛋白強化的牙周膜干細胞膜片的制備與鑒定
　　【目的】
　　通過第二部分的實驗分析，我們發(fā)現(xiàn)相比較離散的

23、單個種子細胞，細胞膜片是一種更好的細胞應(yīng)用載體?？紤]到牙周復(fù)合體再生過程涉及到多種不同軟硬組織的重建，因此探索一種具有多向分化潛能、且質(zhì)量更佳的牙周膜細胞膜片非常必要。釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix derivative，EMD）已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床中牙周缺損的再生治療之中，且被證實可以誘導(dǎo)牙周膜以及牙骨質(zhì)的形成，因此本實驗探索一種釉基質(zhì)蛋白強化的新型牙周膜干細胞膜片，并對其分化潛能進行鑒定。
　　【方法】
　

24、　人PDLSCs的分離、培養(yǎng)；采用乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒檢測含0、25、50、100μg/mL EMD的完全培養(yǎng)液對PDLSCs細胞毒性影響；采用CCK-8法檢測含不同濃度EMD的完全培養(yǎng)液對PDLSCs增殖的影響；以50μg/mL Vc和100μg/mL EMD濃度配置EMD強化的膜片誘導(dǎo)液，然后以此誘導(dǎo)EMD強化的牙周膜干細胞膜片；通過倒置顯微鏡、SEM和HE染色觀察膜片表面以及橫斷面形態(tài)特點；通過Real-time

25、 PCR和免疫組化法檢測基因和蛋白的表達情況；將兩種誘導(dǎo)好的干細胞膜片分別進行為期14d的體外成骨誘導(dǎo)分化，檢測兩種細胞膜片的礦化能力。
　　【結(jié)果】
　　0、25、50、100μg/mL的EMD對于PDLSCs的細胞毒性無顯著性差異（P＞0.05）；不同濃度的EMD對于PDLSCs的增殖作用顯示出劑量依賴效應(yīng)，在第3d和第5d時，50、100μg/mL的EMD組相較其它組具有更多的增殖細胞數(shù)量（P<0.01）；采用含50μ

26、g/mL Vc和100μg/mL EMD的膜片誘導(dǎo)液成功地誘導(dǎo)出 EMD增強的PDLSC膜片；通過大體觀察發(fā)現(xiàn)，EMD增強的PDLSC膜片比常規(guī)誘導(dǎo)的PDLSC膜片更厚，質(zhì)地更致密；通過倒置顯微鏡和 SEM觀察發(fā)現(xiàn)， EMD增強的PDLSC膜片表面形成散在的EMD蛋白聚集體；根據(jù)HE染色和SEM的橫斷面觀察結(jié)果， EMD增強的細胞膜片包含更多層細胞，分泌更豐富的ECM以及形成了更致密連接的膠原纖維網(wǎng)；免疫組化結(jié)果顯示，EMD增強的細胞膜

27、片和常規(guī)誘導(dǎo)的細胞膜片均呈現(xiàn)COL-I的強陽性染色，而ALP和CAP在EMD增強的細胞膜片的表達均略強于常規(guī)誘導(dǎo)膜片；EMD增強的PDLSC膜片表現(xiàn)出以下基因不同的程度的上調(diào)表達，包括：成牙周膜相關(guān)基因（col-I，periostin），成骨相關(guān)基因（runx2，opn，ocn）以及成牙骨質(zhì)相關(guān)基因（cap）；體外礦化誘導(dǎo)實驗證實，EMD增強的細胞膜片顯示出更強的ALP活性，以及更多的礦化結(jié)節(jié)形成。
　　【結(jié)論】
　　利用5

28、0μg/mL Vc和100μg/mLEMD成功地誘導(dǎo)了EMD增強PDLSCsheet；向完全培養(yǎng)液添加100μg/mL的EMD后促進了 PDLSCs的增殖以及 PDLSC sheet中ECM的分泌；Real-time PCR結(jié)果證實EMD強化的細胞膜片促進了成牙周膜、成骨以及成牙骨質(zhì)相關(guān)基因的上調(diào)表達；EMD強化的細胞膜片在體外礦化誘導(dǎo)2 w時顯示出更強的成骨礦化能力。
　　第四部分 PDLSC細胞膜片/PRF/JBMSC細胞膜片

29、復(fù)合結(jié)構(gòu)用于牙周復(fù)合體再生的研究
　　【目的】
　　以PDLSC sheet和JBMSC sheet作為種子細胞的來源，以PDLSC sheet和JBMSC sheet富含的細胞外基質(zhì)以及PRF中豐富的纖維蛋白作為支架材料的來源，以 PRF中緩釋的具有天然配比的自體生長因子作為生長因子的來源。構(gòu)建 PDLSC細胞膜片/PRF/JBMSC細胞膜片復(fù)合結(jié)構(gòu)，然后在裸鼠異位移植模型中驗證其能否用于牙周復(fù)合體的再生。
　　【方

30、法】
　　PRF制備及觀察；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測 PRF中各種生長因子在7d內(nèi)的釋放量；采用Transwell小室的方法檢測不同濃度的PRF誘導(dǎo)PDLSCs和JBMSCs的遷移效果；采用細胞計數(shù)法檢測不同濃度的PRF對兩種干細胞增殖的影響；通過Real-time PCR法檢測兩種干細胞膜片分別與PRF共培養(yǎng)后基因的表達情況；制備表面脫礦的根形牙本質(zhì)支架(TDM)來模擬牙根界面的形態(tài)和微環(huán)境，制備由HA/ TCP構(gòu)成

31、的根形支架來模擬牙槽骨界面的形態(tài)和微環(huán)境，將 TDM插入根形的HA/ TCP支架后，兩者之間形成1mm左右的模擬的牙周缺損間隙。此時我們將PDLSC sheet/PRF/JBMSC sheet復(fù)合體結(jié)構(gòu)移植入此間隙，然后整體移植入裸鼠背部皮下，實驗8周后取材，進行HE,馬松三色以及COL-I免疫組化染色，檢測牙周復(fù)合體組織的再生情況。
　　【結(jié)果】
　　新鮮制備的PRF上部白色區(qū)域主要為粗細不等的纖維蛋白形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而下部

32、紅色區(qū)域含有密集堆積的血小板以及一些嵌入纖維蛋白結(jié)構(gòu)的紅細胞和白細胞等；PRF中各種生長因子的釋放特點呈現(xiàn)時間依賴效應(yīng)，在前3天存在突釋現(xiàn)象，隨時間延長，其釋放量遞減；1/16~1/2 PRF均可以促進兩種干細胞的遷移，但表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。對于PDLSCs的遷移效果分析發(fā)現(xiàn)，1/16PRF組較其它各組誘導(dǎo)細胞遷移效果更佳（p<0.01）。對于JBMSCs的遷移效果分析發(fā)現(xiàn)，1/4PRF組較其它各組誘導(dǎo)細胞遷移效果更佳（p<0.01）；

33、與對照組相比，1/8、1/4、1/2 PRF組均不同程度地促進了PDLSCs和JBMSCs的增殖，PRF促進細胞增殖的能力與劑量無明顯正相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）；關(guān)于PRF對兩種干細胞基因表達的影響，分別與P2代cells組相比，cell sheet組均表現(xiàn)出粘附、礦化相關(guān)基因等幾乎所有基因的上調(diào)表達；而cell sheet/PRF組幾乎抑制了所有與粘附、礦化相關(guān)基因的上調(diào)表達，與P2代cells組相比，cell sheet/PRF組除

34、cemp-1（P<0.05）以及runx2（P<0.05）外，其余基因的表達未發(fā)現(xiàn)明顯差異（P＞0.05）；硬組織切片結(jié)果表明，在 PDLSC膜片/ PRF/ PDLSC膜片組，可見大量同向排列的膠原纖維形成，同時可觀察到豐富血管組織的形成，然而該組未發(fā)現(xiàn)明顯的骨樣組織的形成。在JBMSC膜片/ PRF/JBMSC膜片組，可見豐富的連續(xù)的骨樣組織形成，同時可觀測到穿插其中的新生血管形成。在PDLSC膜片/ PRF/ JBMSC膜片組，檢

35、測到一種PDL/骨樣復(fù)合體組織的形成，該結(jié)構(gòu)在一定程度上類似于牙周復(fù)合體結(jié)構(gòu)。即在TDM表面，我們觀測到了牙骨質(zhì)-牙周膜樣組織的形成，外層靠近HA/ TCP側(cè)，觀察到連續(xù)的骨樣組織的形成。新生的組織互相嵌合緊密，形成有序的排列，并觀察到新生血管組織穿插其中。
　　【結(jié)論】
　　成功地設(shè)計PDLSC膜片/PRF/JBMSC膜片復(fù)合結(jié)構(gòu)中；qPCR結(jié)果證實：PRF可以抑制與之接觸的中間部分細胞膜片的過度礦化，同時發(fā)揮了促進兩種干

36、細胞增殖的作用，在理論上支持了中間部分膜片向牙周膜樣組織分化；裸鼠皮下移植8w后，PDLSC膜片/PRF/PDLSC膜片形成的組織類型主要為牙周膜樣結(jié)構(gòu)，JBMSC膜片/PRF/JBMSC膜片主要為骨樣結(jié)構(gòu)，而在PDLSC膜片/PRF/JBMSC膜片組形成了一種牙骨質(zhì)/PDL/骨樣組織，三種組織有序排列，互相嵌合，該結(jié)構(gòu)在一定程度上類似于牙周復(fù)合體結(jié)構(gòu)。該研究結(jié)果進一步驗證了以下觀點：特定組織來源的干細胞傾向于向獲取源組織的結(jié)構(gòu)和功能方