非誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞膜片復(fù)合PRF修復(fù)兔髁狀突軟骨缺損.pdf

1、背景:
　　顳下頜關(guān)節(jié)(te mpo ro ma nd ib ula r jo int，TMJ)是人體比較重要且復(fù)雜的關(guān)節(jié)，下頜髁突軟骨常常因外傷、炎癥、骨關(guān)節(jié)病等引起損傷。由于關(guān)節(jié)軟骨沒(méi)有血管組織，所以自身對(duì)于缺損的修復(fù)能力較弱,常無(wú)法自行修復(fù)并導(dǎo)致進(jìn)一步破壞。嚴(yán)重者造成關(guān)節(jié)功能喪失，對(duì)病人的生活造成極大障礙。目前，雖有多種方法用于修復(fù)軟骨缺損，但這些修復(fù)的方法都存在很多的局限性。探索一種有效的軟骨修復(fù)方法就成為了一種迫切的需求

2、。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，使越來(lái)越多的人通過(guò)組織工程的方法來(lái)修復(fù)軟骨缺損。前期課題組通過(guò)未分化的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）復(fù)合富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）修復(fù)兔耳軟骨取得了較好的效果。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)想探討一下未分化的ADSCs復(fù)合PRF在體內(nèi)修復(fù)活動(dòng)性的髁狀突軟骨缺失是否具有可行性。
　　目的:
　　探索非誘導(dǎo)ADSCs膜片復(fù)合 PRF

3、植入兔下頜骨髁狀突軟骨缺損處觀察其修復(fù)效果。為治療髁狀突軟骨缺損找到新方法，為臨床病人解決難題。
　　方法:
　　1、從家兔背部獲取脂肪組織，胰蛋白酶消化后離心獲得ADSCs。然后通過(guò)細(xì)胞的生長(zhǎng)表型，成骨與成脂能力的測(cè)定，細(xì)胞表面相應(yīng)抗原的檢測(cè)。來(lái)證明獲得的細(xì)胞就是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。證明后通過(guò)加入抗壞血酸將細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成細(xì)胞膜片，為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　2、從家兔耳緣中動(dòng)脈采集血液，高速離心后獲得PRF膠體，凍干

4、制成粉劑備用。
　　3、建立實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型。通過(guò)手術(shù)的方法暴露家兔髁狀突關(guān)節(jié)面，使用裂鉆制造一直徑3mm、深度3mm累積軟骨下骨的缺損。
　　4、將36只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：空白組、PRF組、ADSCs膜片復(fù)合PRF組，每組12只。都按建立動(dòng)物模型的方法制造軟骨缺損。缺損建立后，空白組不植入任何東西；PRF組植入PRF材料；ADSCs膜片復(fù)合PRF組植入異體ADSCs膜片與PRF的復(fù)合物。術(shù)后1月、2月、3月取材，

5、通過(guò)標(biāo)本大體觀察及組織學(xué)染色的結(jié)果來(lái)確定軟骨缺損的修復(fù)情況。
　　5、采集每一只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前及術(shù)后7d、14d、30d的血液，檢測(cè)其中的CD4、CD8、IL-2、IL-4的水平來(lái)檢測(cè)異體ADSCs移植是否產(chǎn)生了免疫排斥反應(yīng)。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS17進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩樣本均數(shù)的比較采用SNK-q法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05。
　　結(jié)果:

6、　　1、分離的ADSCs在培養(yǎng)皿里呈集落樣漩渦狀生長(zhǎng)，HE染色中核藍(lán)染、胞漿紅染。ADSCs體外成功的誘導(dǎo)成了脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞，表面抗原的流式檢測(cè)結(jié)果為CD29、CD44為高表達(dá)，CD31、CD34、CD45低表達(dá)。這些都復(fù)合ADSCs的特點(diǎn)。
　　2、在空白組髁狀突缺損模型建立后的1月、2月、3月各時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本進(jìn)行肉眼觀及組織學(xué)染色分析，其結(jié)果都表面人為造成的軟骨缺損處幾乎沒(méi)有修復(fù)軟骨組織的形成，這說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑹浅晒Φ摹?/p>

7、
　　3、移植后的修復(fù)情況。肉眼觀與組織學(xué)染色的結(jié)果都顯示：空白組在術(shù)后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)軟骨缺損區(qū)都沒(méi)有修復(fù)的軟骨組織形成，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)缺損底部有新生的骨組織。同時(shí)有少量的軟骨細(xì)胞向新生的骨表面爬行。在PRF組中，術(shù)后未見(jiàn)明顯的新生軟骨組織，缺損兩端僅見(jiàn)少部分正常軟骨爬行形成的軟骨組織缺損明顯。而在ADSCs膜片復(fù)合PRF組中在第一個(gè)月時(shí)見(jiàn)缺損底部有一薄層白色軟骨組織形成，在組織學(xué)染色中其細(xì)胞排列不如正常軟骨規(guī)則色稍淡。在術(shù)后2月時(shí)

8、新生的軟骨組織就已基本填滿缺損，有的地方在與正常組織交接的地方還有微小的間隙。術(shù)后3月時(shí)肉眼下新生組織表面光滑且固有組織的交接處變得更模糊，需仔細(xì)辨認(rèn)方能發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)切片中修復(fù)的軟骨組織更為緊湊單位體積內(nèi)軟骨細(xì)胞的密度更大，新生軟骨組織與骨組織交接的地方出現(xiàn)了部分纖維化和骨化。Image pro-P lus6.0分析得出，缺損修復(fù)術(shù)后3月，空白組修復(fù)率是（1.32±0.23）％，PRF組是（10.37±0.76）%、ADSCs膜片復(fù)合

9、PRF組是（87.25±4.12）%，進(jìn)行兩兩比較方差分析，各組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。就可以得出這樣的結(jié)論：PRF有促進(jìn)軟骨組織形成的作用，但在這種極限缺損范圍內(nèi)的缺損光有PRF還是不夠的還需要種子細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組較好的修復(fù)效果說(shuō)明了未分化ADSCs膜片復(fù)合PRF修復(fù)髁狀突這種功能性軟骨缺損是可行的。
　　4、各實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物在術(shù)前與術(shù)后7d、14d、30d測(cè)量的CD4和CD8細(xì)胞、IL-2、IL-4因子的水平以及計(jì)

10、算出來(lái)的CD4/CD8值，經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析得出各實(shí)驗(yàn)組在組內(nèi)及組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在高倍鏡下觀察HE切片未發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。這就說(shuō)明異體ADSCs未使機(jī)體產(chǎn)生排異反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1、從脂肪組織中獲得的細(xì)胞就是ADSCs，體外分裂能力強(qiáng)。培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單。只需加入一定量的抗壞血酸就能將其誘導(dǎo)培養(yǎng)成細(xì)胞膜片，這樣細(xì)胞的數(shù)量成倍的增多，胞外基質(zhì)和細(xì)胞形成了一三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞穩(wěn)定性好不易流失。適合組織缺