EPC-BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片的構(gòu)建及其對(duì)大鼠牙槽骨缺損修復(fù)效果的研究.pdf

1、牙周組織疾病、口腔頜面部外傷、生長(zhǎng)發(fā)育畸形和頜面部腫瘤等引起的牙槽骨缺損的治療一直是口腔醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)，備受口腔醫(yī)學(xué)學(xué)者的關(guān)注。近年來(lái)，隨著骨組織工程研究的深入，該方法為牙槽骨缺損的修復(fù)和再生開(kāi)辟了新的思路。由于具有良好的自我增殖和分化潛能，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）已然成為了應(yīng)用十分廣泛的種子細(xì)胞。然而，組織工程骨的血管化問(wèn)題以及外源性支架材料的免疫排斥和細(xì)胞利用率低等問(wèn)題，阻礙了骨組織工程的廣泛應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用細(xì)胞膜片技

2、術(shù)，將血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）與BMSCs直接共培養(yǎng)，經(jīng)成膜誘導(dǎo)后，構(gòu)建出復(fù)合細(xì)胞膜片，以修復(fù)大鼠牙槽骨缺損。希望通過(guò)構(gòu)建EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片，探索有利于BMSCs成骨分化能力的更好的微環(huán)境，以提高BMSCs的骨再生能力，為提供效率更高的干細(xì)胞治療牙槽骨缺損修復(fù)與再生的方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　1.分離培養(yǎng)BMSCs及EPCs，構(gòu)建EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片。
　　2.研究EPC/BMSC復(fù)合

3、細(xì)胞膜片的成骨能力，探索提高BMSCs成骨能力的微環(huán)境。
　　3.觀察 EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片修復(fù)大鼠牙槽骨缺損的效果，探尋采用復(fù)合細(xì)胞膜片修復(fù)牙槽骨缺損的新方法。
　　研究?jī)?nèi)容與方法：
　　1.分離獲得BMSCs的方法本實(shí)驗(yàn)選擇密度梯度離心法結(jié)合貼壁法，所培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)通過(guò)倒置顯微鏡來(lái)觀察，細(xì)胞表面分子的表達(dá)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)檢測(cè)，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂方向誘導(dǎo)，檢測(cè)多向分化能力。
　　2.采用密度梯度離

4、心法結(jié)合差速貼壁法，在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基條件下分離并培養(yǎng)EPCs，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的連續(xù)性觀察，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞的表面分子表達(dá)情況、并采用雙熒光染色等方法對(duì)EPCs進(jìn)行鑒定。
　　3.將EPCs與BMSCs直接共培養(yǎng)，經(jīng)成膜誘導(dǎo)后，構(gòu)建出EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片，并對(duì)膜片進(jìn)行HE染色及掃描電鏡觀察。
　　4.將EPCs及BMSCs分別用DiI及DiO熒光染料標(biāo)記，觀察復(fù)合細(xì)胞膜片中兩種細(xì)胞的分布情況；應(yīng)

5、用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞膜片中細(xì)胞的凋亡情況。
　　5.對(duì)細(xì)胞膜片進(jìn)行ALP及茜素紅染色，并對(duì)ALP活性及鈣化結(jié)節(jié)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)和分析；應(yīng)用Real-time PCR及Western blot檢測(cè)手段對(duì)成骨及成血管相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；ELISA檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)情況。
　　6.建立大鼠牙槽骨缺損模型，將細(xì)胞膜片移植入骨缺損區(qū)，對(duì)移植術(shù)后的標(biāo)本進(jìn)行大體觀察，Micro-CT掃描、BV/TV及TMD相

6、關(guān)檢測(cè)，并進(jìn)行HE及Masson染色，觀察骨缺損修復(fù)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)多為紡錘形或多角形，可穩(wěn)定傳代；對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)；對(duì)于造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物，培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎不表達(dá)；培養(yǎng)的細(xì)胞具有能夠向成骨、成脂方向分化的能力。
　　2.培養(yǎng)的 EPCs，早期細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，晚期細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣；細(xì)胞雙重表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物；細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子

7、 vWF；細(xì)胞DiI-ac-LDL與FITC-UEA-1雙重?zé)晒馊旧赎?yáng)性表達(dá)。
　　3.將EPCs與BMSCs直接共培養(yǎng)，經(jīng)成膜誘導(dǎo)10天后，可獲得EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片，膜片呈現(xiàn)半透明膜樣結(jié)構(gòu)，可直接完全從培養(yǎng)皿內(nèi)分離獲得。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示獲得的細(xì)胞膜片具有一定厚度，由多層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。
　　4.隨著直接共培養(yǎng)后成膜誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片中兩種細(xì)胞的胞膜出現(xiàn)某種程度的細(xì)胞膜交換現(xiàn)象。

8、此外，與對(duì)照組（單一BMSC膜片、單一EPC膜片）相比，復(fù)合細(xì)胞膜片具有較低的細(xì)胞凋亡率。
　　5. EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片中堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)的表達(dá)情況高于對(duì)照組（單一BMSC膜片、單一EPC膜片）；復(fù)合細(xì)胞膜片中成骨及成血管等相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)亦高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.在不同觀察時(shí)間點(diǎn)，EPC/BMSC復(fù)合細(xì)胞膜片對(duì)大鼠牙槽骨缺損的修復(fù)能力均強(qiáng)于單一BMSC膜片組與單一EPC膜片組。
　　結(jié)論