脫細胞軟骨基質源性取向性支架作為軟骨組織工程支架的實驗研究.pdf

1、背景與目的:
　　關節(jié)軟骨損傷是臨床上常見的疾病，常因創(chuàng)傷、退變、炎癥、腫瘤等原因導致。軟骨組織是一種高分化組織，一旦損傷，將難以自行修復，隨時間推移將繼續(xù)惡化，給患者帶來關節(jié)功能的影響，降低患者的生活質量。因此，關節(jié)軟骨的修復成為骨科領域的重點和難點。目前，各種治療手段如鉆孔術、關節(jié)成形術、微骨折、自體或異體組織（骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊）移植等被應用于臨床，長期隨訪資料發(fā)現(xiàn):這些修復組織在壓力刺激下容易發(fā)生退變。通過組織工程技術

2、構建的組織工程軟骨被認為是目前最有可能解決此難題的技術手段。
　　組織工程修復軟骨的方法就是將種子細胞培養(yǎng)在生物材料支架上然后移植到缺損部位，形成新的軟骨組織，經(jīng)過重塑形并與機體組織整合在一起，是軟骨組織工程修復軟骨損傷的基本方式。作為組織工程的重要因素之一的支架材料已被廣泛研究，從仿生學角度，支架材料除了提供工程化軟骨樣組織的三維幾何形狀，還為細胞提供了生存的微環(huán)境（人造臨時細胞外基質），支持細胞的粘附、增殖、分化并最終形成新的

3、軟骨組織。
　　將天然豬軟骨超微濕法粉碎，利用定向結晶技術及冷凍干燥技術，采用物理/化學方法交聯(lián)，得到軟骨細胞外基質來源的三維多孔定向取向支架(orientedscaffold，OS)此支架具備了結構，力學和生物化學特性類似于自然軟骨的組織工程支架，管道孔的結構和直徑分布均勻，在一定程度上類似于自然關節(jié)軟骨。然而采用人的關節(jié)軟骨制備支架來源極為有限，我們需要尋求一種材料來源取代之，考慮到豬與人的同源性高，且來源豐富，故利用豬的關節(jié)

4、軟骨作為材料來源制備支架，本實驗將從豬來源關節(jié)軟骨脫細胞基質支架的生物相容性及免疫炎癥反應方面進行評估，以確保其安全性。
　　方法:
　　(1)取豬四肢關節(jié)軟骨，分別制備脫細胞和未脫細胞軟骨支架。在人軟骨細胞中分別加入濃度為100％、50％、25％的脫細胞軟骨支架浸提液[無血清DMEM培養(yǎng)液與支架表面積按1ml:(3-6) cm2比例混合，37℃靜置72h]，計算對增殖率，判定其體外細胞毒性。0.9％ NaCl與支架表面積按

5、1ml:(3-6) cm2比例混合，37℃靜置72h制備脫細胞軟骨支架浸提液，分別用于全身急性毒性實驗（小白鼠）、溶血實驗、熱原檢測實驗、皮內刺激實驗（大白兔），分別觀察其體內毒性、溶血程度、熱原和刺激情況。在大白兔體內分別埋植脫細胞軟骨支架與未脫細胞軟骨支架，觀察炎癥反應和細胞免疫情況。
　　(2)取豬膝關節(jié)關節(jié)軟骨組織，體外分離、培養(yǎng)軟骨細胞，進行蕃紅“O”、甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組化染色等表型鑒定。
　　(3)將軟骨細

6、胞與脫細胞軟骨支架復合，構建出三維多孔組織工程支架，并對其進行大體、電鏡、組織學觀察，
　　(4)采用PKH26熒光染料標記，構建軟骨細胞-ACECM支架復合體，觀察細胞在支架上的生長情況。
　　結果:
　　(1)豬脫細胞軟骨支架浸提液對細胞生長無抑制作用，無細胞毒性。注射支架浸提液后小白鼠一般情況良好，無全身急性毒性反應。支架浸提液溶血程度為1.3％，無溶血作用。支架浸提液無熱原存在且原發(fā)刺激指數(shù)為0分，皮內刺激實驗

7、陰性。脫細胞軟骨支架與未脫細胞軟骨支架相比免疫原性小，無炎癥反應和淋巴細胞浸潤。
　　(2)體外培養(yǎng)的軟骨細胞經(jīng)蕃紅“O”、甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性，證實具有正常軟骨細胞的表型。
　　(3)體外構建的細胞支架復合體，AO-PI染色表明支架內部均為活細胞，組織學結果表明蕃紅“O”、Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，電鏡、組織學以及PKH26熒光標記結果表明隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞在支架中增殖顯著，細胞外有大量基質分泌。<