細(xì)胞外基質(zhì)支架材料在軟骨組織再生和骨組織工程中應(yīng)用的初步探討.pdf

1、研究背景：
　　口腔頜面部骨、軟骨組織生物性再生修復(fù)是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域需要解決的棘手問題?？谇活M面部腫瘤、創(chuàng)傷以及先天性畸形等都會導(dǎo)致頜面部骨和軟骨組織的缺損，如下頜骨成釉細(xì)胞瘤、髁突發(fā)育不良、先天性上頜骨缺失等等。目前，臨床上治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是“自體骨移植”，但這種拆東墻補(bǔ)西墻的修復(fù)方式需要開辟第二戰(zhàn)場，給患者造成二次損傷，病人所受的傷害和所需的花費(fèi)都要增加很多。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)以及蓬勃發(fā)展，為醫(yī)學(xué)上治療這類缺損提供了

2、很好的方向。其中，支架材料作為組織工程領(lǐng)域的三大支柱之一，對組織工程的成功構(gòu)建起著非常重要的作用。現(xiàn)在常用的支架材料主要分為兩類：一是來源于天然組織，如膠原等；二是人工合成的高分子支架材料，如PCL等。兩種材料都各有其優(yōu)勢和不足。其中，細(xì)胞外基質(zhì)支架材料（ECM）由于其在組織形成和器官發(fā)育中的重要作用而被人們所熟悉并深入研究，而且，ECM對于細(xì)胞的生物學(xué)行為如遷移、增殖和分化等也有著直接的影響。因此ECM作為一種支架材料有著其獨(dú)特的優(yōu)勢

3、。本實(shí)驗就是著眼于探討ECM支架材料在軟骨再生和骨組織工程中的應(yīng)用，為以后臨床應(yīng)用ECM修復(fù)組織缺損提供一些可靠的依據(jù)。
　　第一部分：軟骨細(xì)胞來源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料在軟骨再生中應(yīng)用的初步探討
　　實(shí)驗一、軟骨細(xì)胞膜片的構(gòu)建
　　目的：探討軟骨細(xì)胞膜片的構(gòu)建方法，并分析其結(jié)構(gòu)特征。
　　方法：分離4周齡幼兔的耳軟骨細(xì)胞，在高糖DMEM培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)2周；然后對獲得的膜片進(jìn)行大體學(xué)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的觀察。<

4、br>　　結(jié)果：幼兔耳軟骨細(xì)胞分離后生長狀態(tài)良好，連續(xù)培養(yǎng)2周后即可形成膜片狀結(jié)構(gòu)；HE和番紅O染色均證實(shí)了膜片是由軟骨細(xì)胞及其自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix, ECM）構(gòu)成，掃描電鏡（Scanning electronic microscope, SEM）和投射電鏡（Transmission electron microscope, TEM）也都證實(shí)了軟骨細(xì)胞膜片是由大量的ECM和鑲嵌在其中的軟骨細(xì)胞構(gòu)

5、成。
　　結(jié)論：軟骨細(xì)胞經(jīng)過適宜的培養(yǎng)后可以形成膜片狀結(jié)構(gòu)，可用于以后的實(shí)驗。
　　實(shí)驗二、軟骨細(xì)胞來源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的制備及其特征分析
　　目的：探討軟骨細(xì)胞膜片最佳的脫細(xì)胞方法，并分析其脫細(xì)胞前后組織結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特征等有無變化。
　　方法：取實(shí)驗一培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞膜片，然后分別在1％、5%和10%SDS中脫細(xì)胞處理24h，然后均再經(jīng)過1%TritonX-100和脫氧核糖核酸酶中去除細(xì)胞碎片和殘余的DNA

6、，在對其進(jìn)行組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)以及生物力學(xué)的檢測，分析其脫細(xì)胞前后特性有無變化。
　　結(jié)果：1%、5%和10%SDS三組處理方法均可比較徹底地去除細(xì)胞，但10%SDS會對細(xì)胞膜片的結(jié)構(gòu)和特性造成很大的損害；而1%SDS既能比較徹底地脫細(xì)胞，又能在最大程度上維持細(xì)胞膜片原有的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特征。
　　結(jié)論：1%SDS是本實(shí)驗中最佳的脫細(xì)胞方法，脫細(xì)胞后所獲得ECM可以用于下一步的實(shí)驗。
　　實(shí)驗三、軟骨細(xì)胞來源的細(xì)胞

7、外基質(zhì)支架材料在兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損修復(fù)作用的初步探討
　　目的：探討ECM在軟骨缺損中的修復(fù)作用，并比較1%、5%和10%SDS三種脫細(xì)胞方法的優(yōu)劣。
　　方法：35只成年新西蘭大白兔隨機(jī)分為四組，分別為1%、5%、10%SDS和空白對照組，另外三只作為陽性對照；膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型建立后，分別植入已成功制備的ECM支架材料；在移植后的6周和12周時，分別安樂死犧牲掉實(shí)驗動物，取材進(jìn)行大體學(xué)觀察、Micro-CT掃描和組織學(xué)

8、染色，并做大體學(xué)和組織學(xué)評分；比較各實(shí)驗組間有無差異。
　　結(jié)果：三個實(shí)驗組均可在一定程度上修復(fù)骨軟骨缺損，但大體學(xué)和組織學(xué)分析均證實(shí)1%SDS制備的ECM具有最好的修復(fù)效果，在移植12周后，缺損處已基本被新生的透明軟骨組織所充填；而且Micro-CT掃描也表明1%DS組中，軟骨下骨板再生情況最好。
　　結(jié)論：1%SDS是最佳的脫細(xì)胞方法，經(jīng)過1%SDS制備而來的ECM可以很好地修復(fù)骨軟骨缺損，該ECM支架材料可作為一種新型

9、的生物材料用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)。
　　實(shí)驗四、軟骨細(xì)胞來源的細(xì)胞外基質(zhì)支架材料修復(fù)作用機(jī)制的初步探討
　　目的：初步探討軟骨細(xì)胞來源的ECM支架材料在骨軟骨缺損修復(fù)中的作用機(jī)理。
　　方法：首先利用Transwell小室分析VEGF和BMSCs對內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有無影響，并通過添加VEGF抑制劑V1來觀察VEGF被抵消后，各實(shí)驗組中內(nèi)皮細(xì)胞的遷移率有無變化；然后再分析 ECM對 BMSCs的遷移有無影響；最后再通過RT

10、-PCR和Western Blot分析ECM對BMSCs的分化有無影響。
　　結(jié)果：VEGF、BMSCs和軟骨細(xì)胞磚（Chondrocytes bricks, CB）等都對內(nèi)皮細(xì)胞的遷移具有促進(jìn)作用，而且BMSCs與最佳濃度的VEGF（10ng/ml）的促進(jìn)作用相當(dāng)，但當(dāng)加入VEGF抑制劑V1后，內(nèi)皮細(xì)胞遷移率明顯降低，說明BMSCs可通過分泌VEGF來募集更多的內(nèi)皮細(xì)胞；同時ECM還可以促進(jìn)BMSCs的遷移，而且RT-PCR和W

11、estern Blot也證明了軟骨細(xì)胞來源的ECM可以降低BMSCs的骨向分化和增加其軟骨向分化的能力。
　　結(jié)論：由于ECM或是富含ECM的CB具有很多生物活性成分，可以募集更多的干細(xì)胞達(dá)到缺損部位，啟動修復(fù)和再生過程；而募集而來的干細(xì)胞又可以促進(jìn)更多的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移而來，同時也會分泌更多的VEGF，從而有利于組織再生的形成和維持；而同時，ECM又可以促進(jìn) BMSCs的成軟骨向分化，抑制其骨向分化，最終達(dá)到了軟骨修復(fù)和再生。<

12、br>　　第二部分：基于細(xì)胞外基質(zhì)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片在骨組織工程中應(yīng)用的初步探討
　　實(shí)驗一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合富血小板纖維蛋白在兔顱骨極限缺損修復(fù)作用的初步探討
　　目的：我們前期實(shí)驗已經(jīng)在裸鼠體內(nèi)證實(shí)了富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin, PRF）可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）膜片的成骨能力，本實(shí)驗旨在驗證B

13、MSCs膜片-PRF復(fù)合體在骨缺損修復(fù)中是否有作用。
　　方法：15只新西蘭大白兔隨進(jìn)分為三組：空白對照組（只做顱骨極限缺損而沒有任何治療）；BMSCs膜片組（顱骨極限缺損+BMSCs膜片）；BMSCs膜片-PRF復(fù)合組：（顱骨極限缺損+BMSCs膜片-PRF復(fù)合體）。移植8周后對其進(jìn)行Micro-CT掃描和組織學(xué)分析。
　　結(jié)果：空白對照組中僅有少量纖維組織覆蓋缺損，而BMSCs膜片組中雖然有少量骨形成，但不足以修復(fù)缺損；

14、但在BMSCs膜片-PRF復(fù)合組中，則可見大量新生的骨組織；新生骨體積/新生所有組織體積（ Bone volume/Total volume, BV/TV）和組織學(xué)半定量分析也證實(shí)了BMSCs膜片-PRF復(fù)合組中缺損修復(fù)的效果最好。
　　結(jié)論：BMSCs膜片-PRF復(fù)合體可以用于骨組織的缺損修復(fù)，該方法可作為一種新型的組織工程骨的構(gòu)建方法，將來也許可以應(yīng)用于臨床。
　　實(shí)驗二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合脂肪來源干細(xì)胞構(gòu)建組織工

15、程骨的實(shí)驗研究
　　目的：探討脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）能否促進(jìn)BMSCs膜片的成骨能力。
　　方法：首先從同一供體身上分離培養(yǎng)ADSCs和BMSCs膜片，然后構(gòu)建BMSCs膜片-ADSCs復(fù)合體，8只裸鼠隨機(jī)分為兩組：BMSCs膜片組，BMSCs膜片-ADSCs復(fù)合組；移植到裸鼠的背部皮下，移植8周后對其進(jìn)行Micro-CT掃描和組織學(xué)分析。
　　結(jié)果

16、：BMSCs膜片組中有少量散在分布的骨小梁和骨島形成，但新生骨組織量很少；但在BMSCs膜片-ADSCs復(fù)合組中，則可見大量新生的骨組織和未完全成熟鈣化的軟骨組織；BV/TV和組織學(xué)半定量分析也證實(shí)了BMSCs膜片-ADSCs復(fù)合組中新生骨量更多。
　　結(jié)論：BMSCs膜片-ADSCs復(fù)合體可以用于組織工程骨的構(gòu)建。該方法可作為一種新型的組織工程骨的構(gòu)建方法，將來也許可以應(yīng)用于臨床中。
　　實(shí)驗三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片復(fù)合高

17、溫煅燒鴕鳥骨支架材料構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗研究
　　目的：探討B(tài)MSCs膜片和高溫煅燒鴕鳥骨（Ostrich true bone ceramic,OTBC）支架材料用于構(gòu)建組織工程骨的可能性。
　　方法：首先制備OTBC支架材料，分析其理化特征、生物相容性和生物降解性，然后將預(yù)先培養(yǎng)的BMSCs膜片與OTBC復(fù)合后移植到裸鼠背部皮下觀察期能否成骨，單純OTBC材料作為對照組；移植8周后，組織學(xué)分析觀察其成骨情況。
　　結(jié)