去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為支架材料組織工程角膜的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、研究背景與目的 各種疾病造成的角膜基質(zhì)不可逆性混濁是視力喪失的主要原因，在致盲病因中位居第二，僅次于白內(nèi)障。角膜盲最有效的治療方法是穿透性角膜移植，但是供體來源不足、免疫排斥反應(yīng)、角膜移植并發(fā)癥等限制了此項技術(shù)的開展。有些角膜移植的高?；颊?，如角膜緣干細(xì)胞缺損導(dǎo)致的嚴(yán)重干眼癥，是角膜移植的絕對禁忌癥。因此有必要尋找一種新的角膜替代物。 角膜替代物主要分為二類：人工角膜和組織工程角膜等效物（TECE）。 TECE

2、是以細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建的活性替代物，主要由天然角膜的三種細(xì)胞和膠原成分構(gòu)成。構(gòu)建組織工程角膜等效物的關(guān)鍵是支持細(xì)胞三維生長的支架材料。以膠原為基礎(chǔ)的天然生物聚合膠表現(xiàn)了極好的生物學(xué)特性，支持細(xì)胞三維生長，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于組織工程技術(shù)。目前尚無以此構(gòu)建的TECE 臨床應(yīng)用的報道，主要原因是膠原韌性差，不耐受縫合。 去細(xì)胞處理的異種組織主要成分為膠原、彈力纖維等，形態(tài)與韌性變化較小。而且去細(xì)胞處理可以降低異種組織的炎癥反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng)

3、，擴充組織來源。在組織工程技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)研究中，去細(xì)胞生物支架材料如心臟瓣膜、血管、皮膚、神經(jīng)、骨骼肌、腱膜、韌帶、小腸粘膜下組織、膀胱和肝臟，已經(jīng)進(jìn)入臨床前期動物實驗或臨床治療階段。我課題組先期研究中利用酶－去污劑聯(lián)合方法對豬角膜基質(zhì)進(jìn)行去細(xì)胞處理，凍干或無水氯化鈣脫水保存，生物相容性好，可修復(fù)無菌性角膜潰瘍、角膜化學(xué)燒傷（堿燒傷）；缺點是有去污劑殘留可能，材料透明度差。本研究旨在①改進(jìn)去細(xì)胞方法與保存方式，與去污劑處理的材料在生物相

4、容性和透明度方面進(jìn)行比較；②利用單純CAM 板層移植或全層移植修復(fù)兔角膜潰瘍；③以CAM 為支架體外構(gòu)建TECE，觀察TECE 在大鼠穿透性角膜移植模型中對新生血管的抑制作用。 內(nèi)容與方法 1．CAM 的制備取自當(dāng)?shù)赝涝讏龅男迈r豬眼球100 個，沿角鞏膜緣切取角膜，低滲處理后剖分為兩部分，用10－0 單絲尼龍線標(biāo)記前彈力層面和后彈力層面。通過凍融、酶消化（胰酶、核酸酶）、機械攪拌等處理去除組織內(nèi)的細(xì)胞成分。 HE

5、 組織學(xué)染色檢測去細(xì)胞情況，取一片晾干材料進(jìn)行掃描電鏡檢測。 2．CAM 生物相容性評價22 只雄性新西蘭白兔，體質(zhì)量2－2.5kg，2 只新生兔。CAM 體外接種兔角膜基質(zhì)細(xì)胞、角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)植入、前房內(nèi)植入觀察其相容性。 3．單純CAM 為植片修復(fù)兔角膜潰瘍于術(shù)前一周制備兔角膜潰瘍模型。12 只角膜潰瘍兔隨機分為二組，分別接受板層或全層移植治療，排除穿透性移植術(shù)中出現(xiàn)并發(fā)癥的1 例，術(shù)后進(jìn)行裂隙燈顯微鏡、超聲生物顯微

6、鏡、透射電鏡檢查和光鏡檢查。 4．體外構(gòu)建TECE，觀察穿透性移植后對新生血管的抑制作用SD 大鼠20 只，體質(zhì)量200－250g，雌雄不限。隨機分為2 組，分別接受單純CAM 為植片、TECE 為植片的穿透性角膜移植。利用PKH26 標(biāo)記的新生鼠角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞接種于CAM 上，氣液面培養(yǎng)構(gòu)建TECE。于術(shù)后2、4、8、16、20 周取材進(jìn)行HE 組織學(xué)染色檢查，冰凍切片熒光顯微鏡檢查，24 周TECE 組進(jìn)行透射電鏡檢

7、查。 結(jié)果 1．CAM 大體形態(tài)及組織學(xué)觀察改進(jìn)方法處理的CAM 幾乎透明，表面光滑，韌性強，可縫合，但缺乏天然角膜曲率。HE 提示去細(xì)胞徹底，膠原板層保存完好，掃描電鏡提示材料表面有基底膜樣結(jié)構(gòu)。凍干或無水氯化鈣脫水保存的CAM 不透明，表面粗糙，膠原有斷裂，孔隙約200μm。 2．CAM 相容性檢測體外接種角膜基質(zhì)細(xì)胞，7 天時HE 染色見CAM 表面有單層細(xì)胞附著。前房內(nèi)、角膜囊袋內(nèi)植入術(shù)后1 個月取材，提

8、示CAM 在基質(zhì)內(nèi)未引起免疫排斥反應(yīng)，但是無角膜基質(zhì)細(xì)胞長入CAM 微孔內(nèi)；植入前房的CAM 表面有成纖維細(xì)胞包繞。 3．單純CAM 移植后細(xì)胞再生所有植片均可見自體細(xì)胞再生。術(shù)后1－2 周，角膜上皮細(xì)胞層開始重建，熒光素鈉染色不均，有不規(guī)則的角膜上皮缺失，修復(fù)的角膜上皮來源于角鞏膜緣、周邊植床。4 周時角膜上皮融合，復(fù)層化。掃描電鏡提示角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入膠原板層，分泌膠原原纖維。術(shù)后4－7 天出現(xiàn)角膜新生血管，14－20天角膜血

9、管翳越過植床植片交界處，32 周時新生血管明顯消退。板層移植角膜植片15 個月后透明，恢復(fù)自然曲率。 4．TECE 體外構(gòu)建與體內(nèi)移植角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞在CAM 表面匍行貼附生長，移植后取材見角膜上皮細(xì)胞復(fù)層化，與正常角膜上皮細(xì)胞相似，但是無紅色熒光標(biāo)記；角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，沿膠原板層浸潤，并分泌新生膠原纖維；TECE對角膜新生血管有明顯的抑制作用；24 周植片掃描電鏡檢查有神經(jīng)纖維長入。 結(jié)論 1

10、．去細(xì)胞徹底，CAM 具有良好的力學(xué)及光學(xué)性能采用低滲、凍融、酶消化法進(jìn)行和緩的去細(xì)胞處理，能夠徹底去除細(xì)胞，減小對ECM的損傷，保留基底膜、后彈力層；改為晾干保存，有利于提高CAM力學(xué)及光學(xué)性能。 2．組織相容性好改進(jìn)方法處理的CAM無有害物質(zhì)殘留，無免疫源性，組織相容性良好，角膜囊袋內(nèi)移植后CAM降解速度緩慢，足以支持自體角膜組織再生與重建。 3．CAM 可以修復(fù)兔角膜潰瘍CAM原位移植后，誘導(dǎo)自體上皮細(xì)胞復(fù)層化，基

11、質(zhì)細(xì)胞能夠沿膠原板層移行，并分泌膠原原纖維。最終植片透明，恢復(fù)自然角膜曲率。4．TECE 抑制角膜新生血管預(yù)先接種了上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的TECE 增強了手術(shù)創(chuàng)口的抗炎能力，能夠抑制角膜植片新生血管發(fā)生，支持角膜神經(jīng)的修復(fù)與重建。 綜上所述，晾干CAM 具有良好的生物相容性，韌性強，透明度高，體內(nèi)支持細(xì)胞三維生長，能與自身分泌的膠原整合，支持神經(jīng)纖維重建，植片最終透明，恢復(fù)自然曲率；單純的CAM 穿透性或板層移植可以治療兔角膜潰瘍