殼聚糖構建組織工程角膜基質的實驗研究.pdf

1、目的 1、探討以殼聚糖為主要材料構成的組織工程角膜支架的生物相容性。 2、培養(yǎng)保持正常表型的三種角膜細胞。 3、試用殼聚糖支架材料構建組織工程角膜基質方法。 (一)以殼聚糖為主要材料構建的組織工程角膜支架的生物相容性比較及篩選 1、殼聚糖為主要材料的組織工程角膜支架的構建： (1)將殼聚糖、膠原蛋白、硫酸軟骨素、透明質酸鈉等溶液按照90:6:2:2的比例混合，以原花青素和戊二醛溶液作為交聯(lián)

2、劑分為兩組，分別制成不帶孔和帶孔的兩種支架。 (2)分別測量帶孔支架的含水率和膨脹率；對四種殼聚糖支架做石蠟切片染色觀察合成的支架的孔徑等形態(tài)。 2、殼聚糖支架材料生物相容性比較及篩選實驗：40只新西蘭大白兔分為A、B、C、D、E5組，每組8只，取右眼為手術眼。A、B兩組分別為原花青素和戊二醛交聯(lián)的帶孔支架材料組，C、D兩組分別為原花青素和戊二醛交聯(lián)的不帶孔支架材料組，E組為空白對照組。每組制作直徑6mm的囊袋，分別植入

3、四種支架材料，每日觀察記錄角膜水腫、浸潤及新生血管情況，在1周、4周、6周、2月、4月、6月、9月、10月、11月等進行裂隙燈顯微鏡觀察照相，并取材行組織病理學檢查。比較不同的支架材料對角膜的影響。 (二)培養(yǎng)保持正常表型的三種角膜細胞 1、角膜上皮細胞培養(yǎng)：取新西蘭大白兔角膜緣組織置于培養(yǎng)板和羊膜上，加入DMEM/F12。 2、角膜基質細胞培養(yǎng)：角膜基質組織剪成1mm左右組織塊，分別置于培養(yǎng)板和羊膜上，加入DM

4、EM/F12。將培養(yǎng)板中培養(yǎng)的角膜基質細胞分A、B兩組，待培養(yǎng)板中的細胞80％融合后傳代，A組改用含添加劑的DMEM無血清培養(yǎng)基；B組和羊膜上培養(yǎng)組繼續(xù)用DMEM/F12(內含10％胎牛血清)培養(yǎng)。 3、角膜內皮細胞培養(yǎng)：將含有內皮細胞的后彈力層內皮面朝下置于培養(yǎng)板中，加入DMEM/F12。 4、培養(yǎng)的三種角膜細胞的觀察及生物學性質(1)形態(tài)觀察：倒置顯微鏡下每日觀察細胞形態(tài)。 5、免疫組化檢測：檢測角膜上皮細胞

5、特異性角蛋白K3、K12(AE5)，角膜基質細胞的中間絲蛋白(Vim)，角膜內皮細胞的神經(jīng)纖維絲蛋白(NF)。 6、分子生物學檢測：RT-PCR檢測在羊膜和培養(yǎng)板上A、B兩組培養(yǎng)的角膜基質細胞特異性keratocan蛋白的表達。 (三)培養(yǎng)的三種角膜細胞分別與篩選出的原花青素交聯(lián)的殼聚糖支架共培養(yǎng)構建角膜基質 1、三種角膜細胞與殼聚糖支架共培養(yǎng)支架與三種角膜細胞分別共培養(yǎng)，HE染色作組織病理檢測。 2、帶

6、有上皮細胞的支架做兔角膜板層移植16只新西蘭大白兔平均分為兩組，每組取右眼為手術眼，5mm環(huán)鉆鉆取約1/3角膜厚度的板層組織，分別移植帶上皮細胞的原花青素交聯(lián)的兩種支架，每日觀察。 結果 (一)殼聚糖為主要材料按比例合成的組織工程角膜支架的生物相容性及篩選 1、殼聚糖為主要材料的組織工程角膜支架的構建： ①大體形態(tài)：原花青素交聯(lián)的不帶孔的支架呈棕色，具有一定的透明度，戊二醛交聯(lián)的支架呈透明的薄膜；原花青素

7、交聯(lián)的帶孔的支架呈棕色，不透明，有空隙，戊二醛交聯(lián)的支架，呈白色，不透明，海綿狀。 ②.帶孔的組織工程角膜支架的特點：含水率：77.8％；膨脹率：76.0％ ③.HE染色：(1)帶孔的支架：支架材料紅染，具有不規(guī)則的孔徑，連成網(wǎng)狀，原花青素交聯(lián)的支架孔徑比戊二醛交聯(lián)的規(guī)則，多呈四角形，戊二醛交聯(lián)的支架呈多角形，連成網(wǎng)狀。 (2)不帶孔的支架：單層紅染無孔隙的膜。 2、殼聚糖為主的支架材料生物相容性實驗及篩選：

8、 (1)裂隙燈顯微鏡觀察記錄眼部一般情況： 術后A、B兩組較C、D兩組炎癥反應重，角膜水腫明顯；E組炎癥反應最輕，基本保持透明。 ①帶孔的支架A、B組：術后1周實驗組共有3只眼植片脫落，其中A組1只眼，B組2只眼。A、B兩組術后1周都有結膜睫狀充血、角膜水腫情況。2周后充血水腫逐漸消失，B組消失最晚。術后3周A組5只眼長入角膜新生血管，B組有6只眼；術后6周都有新生血管長入，B組較A組多，A組支架材料的棕色變淺，B組

9、呈白色；術后4個月仍有較多新生血管，術后6月A、B兩組新生血管開始變小；9月時材料大部分降解，10月A、B兩組的植入材料仍未完全吸收，角膜中少量新生血管長入，11月時新生血管基本消失。12月后兩組角膜透明，僅見輕微瘢痕。 ②不帶孔的支架C、D兩組：術后僅有C組1只眼支架發(fā)生脫落，兩組角膜水腫和浸潤情況無明顯差別，1月時均有新生血管長入，術后2月新生血管開始變小，4個月內兩組的植入材料均透明，材料已大部降解；5月后角膜透明，僅見輕

10、微瘢痕；6個月時完全透明，未見明顯瘢痕。③對照組E組：僅術后2天角膜輕度水腫，以后水腫消退，角膜透明，無感染，無新生血管生長。 (2)組織病理與免疫組化： ①帶孔支架的A、B兩實驗組取不同時間的標本HE染色：2周時兩組支架材料中有大量的炎癥細胞，B組炎癥細胞較A組多，兩組均有少量的基質細胞長入，E組角膜標本與正常角膜無區(qū)別。3月后A、B兩組植入支架材料區(qū)域上皮細胞增厚，表層上皮完整，材料周邊有新生膠原和角膜基質細胞。材料

11、部分降解，并可見材料碎片。10月時材料基本吸收，已被新生膠原和角膜基質細胞取代，免疫組化結果顯示基質細胞的非特異性抗體Vim染色陽性。12月基本與正常角膜相同。②不帶孔支架的C、D兩組取不同時間的標本HE染色：2周時無明顯炎癥細胞反應，4月時材料已經(jīng)大部分吸收，角膜中遺留空隙；5月時空隙基本消失。 (二)培養(yǎng)的保持正常表型的三種角膜細胞 1、上皮細胞培養(yǎng)：上皮細胞生長旺盛，大部分保持正常細胞形態(tài)，AE5染色呈陽性。

12、 2、基質細胞培養(yǎng)：在羊膜和培養(yǎng)板上原代培養(yǎng)的細胞及無血清培養(yǎng)基條件下的傳代細胞均保持正常的角膜基質細胞形態(tài)，分子生物學檢測keratocan蛋白陽性表達；Vim染色呈陽性。 3、內皮細胞培養(yǎng)：內皮細胞在培養(yǎng)板上生長良好，NF染色陽性。 (三)培養(yǎng)的三種角膜細胞分別與所篩選出的原花青素交聯(lián)的殼聚糖支架共培養(yǎng)構建組織工程角膜基質 1、三種角膜細胞與殼聚糖支架共培養(yǎng)： 角膜上皮細胞、基質細胞可以在支架上生長

13、，HE染色顯示細胞均在支架表面生長，支架內部幾乎沒有細胞長入。內皮細胞較難在支架表面上生長。 2、帶有上皮細胞的支架板層移植殼聚糖支架周邊逐漸變白，角膜輕度水腫，1周時不帶孔支架全部脫落，2周時帶孔支架全部脫落。 結論： 1、原花青素交聯(lián)殼聚糖、膠原蛋白等組成的支架材料對角膜組織的刺激性小，與角膜組織具有良好的生物相容性，原花青素可能比戊二醛更適合作為組織工程角膜支架材料的交聯(lián)劑。 2、可以通過合適的培養(yǎng)