組織工程人后板層半角膜體外構建的實驗研究.pdf

1、角膜(Cornea)是位于眼球表面的一層透明組織，是維持正常視功能的重要結構，由于位于眼表的最外層，因而極易受到損傷和感染，致使角膜病是引起視力下降甚至致盲的主要因素，目前主要依賴于角膜移植手術進行治療。據(jù)流行病學調(diào)查顯示，我國現(xiàn)有角膜病盲患者300余萬，均需要通過角膜移植進行治療，但因捐獻角膜數(shù)量有限和供體角膜老化，每年能接受手術治療的患者只有1000余人，絕大多數(shù)患者因得不到可用的供體角膜而無法接受角膜移植和復明。目前，體外構建的組

2、織工程角膜(Tissue-engineered human cornea)作為捐獻角膜的替代物，是解決供體角膜匱乏的主要途徑，已成為眾多角膜病盲患者重見光明的希望。組織工程角膜體外構建的核心要素是種子細胞(Seeder cells)、載體支架（Carrier scaffold）和信號分子(Signalingmolecules)。組織工程角膜的體外構建，要求種子細胞必須能夠持續(xù)保持細胞固有的形態(tài)結構、旺盛的增殖能力、穩(wěn)定的遺傳性能和發(fā)揮固

3、有功能的潛能，要求載體支架必須具有與天然角膜類似的光學性能、三維網(wǎng)架結構、生物相容性和機械強度。獲得足量正常的種子細胞和生物相容性理想的的載體支架是開展組織工程角膜體外構建研究的前提條件。
　　人角膜在組織結構上由上皮層(Epithelium)、前彈力層(Bowman's membrane)、基質(zhì)層(Stroma)、后彈力層(Descemet' membrane)和內(nèi)皮層(Endothelium)構成。其中，人角膜基質(zhì)(Human

4、 cornea stroma，HCS)由交錯排列的200-250個膠原板層結構和散在分布的HCS細胞組成，占角膜厚度的90％，在角膜厚度和透明度維持中具有關鍵作用;而人角膜內(nèi)皮(Human cornea endothelium，HCE)位于角膜最內(nèi)層、由連接緊密的單層HCE細胞鑲嵌而成，是角膜和前房的天然屏障，通過泵-漏機制維持角膜透明度并為角膜供養(yǎng)/氧，在角膜厚度和透明度維持中具有決定性作用。在角膜受到深度創(chuàng)傷和感染時，往往會傷及深層

5、HCS和HCE，即后板層半角膜，輕者引起角膜水腫和角膜內(nèi)皮失代償，重者甚至致盲。目前后板層半角膜的治療方法主要是通過單層HCS和HCE的多次角膜移植手術，不僅增加了手術創(chuàng)傷和感染的風險，而且在角膜愈合和移植瘢痕殘留方面也存在有諸多缺陷。因此，體外構建出可用于移植的組織工程人后板層半角膜(Tissue-engineered posterior hemicornea，TE-pHC)已成為學者們新的研究熱點。本文研究目的就是利用本實驗室自主建

6、立的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCE細胞系和HCS細胞系作為種子細胞，以帶后彈力層的脫細胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine cornealstromata with Descemet' membrane，aPCS-DM)為載體支架，進行TE-pHC的體外構建研究，旨在獲得與活體角膜后半層組織結構高度近似的TE-pHC。
　　為了獲得足量正常的TE-pHC種子細胞，本文首先對非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCS和HCE組織細胞系細胞進行了體外

7、擴增培養(yǎng)，并對其形態(tài)結構、增殖活性、染色體屬性以及細胞標志蛋白和功能蛋白的表達進行了鑒定。光鏡觀察結果發(fā)現(xiàn)，體外擴增培養(yǎng)的第1批65代HCE細胞形成匯合單層時呈多角形的六邊形內(nèi)皮樣細胞形態(tài)，第28批63代HCS細胞形態(tài)呈梭型，仍然具有其原有細胞的形態(tài)特征;生長與增殖活性的檢測結果顯示，HCE細胞和HCS細胞的群體倍增時間分別為48.54 h和38.28 h，仍保持有旺盛的體外增殖能力;染色體組型分析結果發(fā)現(xiàn)，這兩種細胞的特征性染色體數(shù)目

8、均為2n=46條，仍具有人類染色體的特征;免疫細胞化學檢測結果顯示，HCE細胞和HCS細胞仍分別保持有HCE細胞標志蛋白——人血管內(nèi)皮生長因子受體-2(FLK-1)和HCS細胞標志蛋白——波形蛋白的陽性表達，表明兩種細胞仍保持有HCE細胞和HCS細胞的固有屬性。對HCE細胞和HCS細胞功能蛋白的免疫細胞化學檢測結果發(fā)現(xiàn)，HCE細胞仍保持有細胞連接形成蛋白——緊密連接蛋白1(ZO-1)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白αv/β5

9、以及膜運輸?shù)鞍住狽a+/K+-ATPase的陽性表達，而HCS細胞保持有CX-43和整聯(lián)蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脫氫酶3(ALDH3)的陽性表達，證明這兩種細胞均仍然保持有形成細胞-細胞間、細胞-細胞外基質(zhì)間細胞連接和執(zhí)行膜運輸功能的潛能，且HCS細胞保持有抗紫外損傷的潛能。上述鑒定結果證明，第65代HCE細胞和第63代HCS細胞在體外擴增培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細胞屬性正常，增殖能力旺盛，并依然保持有形成細胞連

10、接和執(zhí)行膜運輸功能的潛能，符合作為組織工程角膜種子細胞的各項條件，可以被用于TE-pHC體外構建的種子細胞。
　　為了獲得形態(tài)結構與天然角膜類似的TE-pHC載體支架，本文以新鮮豬角膜為材料進行了aPCS-DM支架的制備和鑒定。我們利用凍融循環(huán)聯(lián)合核酸酶消化的方法進行脫細胞處理，經(jīng)核黃素交聯(lián)及風干處理，獲得了aPCS-DM載體支架。用于構建TE-pHC前，分別對光學性能、組織結構、理化性質(zhì)和機械性能進行了檢測和評價。光學性能檢測結

11、果顯示，aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜，具有良好的光學性能。組織學檢查結果顯示，經(jīng)過脫細胞處理后aPCS膠原板層仍保持排列規(guī)則且結構致密，后彈力層完整且表面平整，異種細胞在處理過程中被去除;理化性質(zhì)檢測結果顯示，含水量略高于天然角膜，aPCS中DNA殘留量低且符合醫(yī)用生物材料標準，糖胺聚糖分布與天然角膜相似。生物力學性能檢測結果顯示，aPCS在生物力學性能上與天然角膜無顯著差異。上述結果表明，本文制備的aPCS-DM支架具有良好

12、的光學性能，三維組織結構和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似，生物力學性能優(yōu)良，滿足作為構建TE-pHC的載體支架材料的要求。
　　為了進一步檢測載體支架與兩種細胞的生物相容性，本文對aPCS支架進行了細胞毒性評價和接種細胞后的免疫組織化學檢測。利用HCE細胞和HCS細胞進行MTT細胞毒性的檢測結果顯示，制備的aPCS無細胞毒性作用。接種HCS細胞和HCE細胞后aPCS的的免疫組織化學結果顯示，細胞在載體支架內(nèi)部和后彈力層表面均能陽性表達

13、其標志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白。上述結果綜合表明，aPCS支架不僅無細胞毒性，還能夠為細胞的黏附、增殖和功能表達提供合適的三維空間結構，具備良好的生物相容性，是作為TE-pHC體外構建的理想支架材料。
　　在已獲得種子細胞和載體支架的前提下，為了構建具有功能的TE-pHC，本實驗進行了TE-pHC的體外構建并對其進行了鑒定。本文通過比較HCE細胞和HCS細胞的不同接種方式和摸索細胞接種時間建立了TE-pHC的構建技術路線:微量

14、注射的方法將HCS細胞接種于aPCS支架的基質(zhì)中，培養(yǎng)24 h后將接種過HCS細胞的植片后彈力層面向上直接法接種HCE細胞，繼續(xù)培養(yǎng)至4天，從而構建出TE-pHC。對TE-pHC進行組織結構和功能檢查，茜素紅染色結果說明HCE細胞在后彈力層面形成連續(xù)的單層，細胞密度為2910±420個/mm2的密度，相當于健康成人30歲左右的內(nèi)皮細胞密度;H&E染色結果顯示HCS細胞在注射點附近支架黏附并伸展，向周圍擴散分布，HCE細胞連續(xù)完整單層與后

15、彈力層結合緊密;TE-pHC的電鏡結果顯示，HCE細胞在aPCS后彈力層上形成的單層細胞表面平整，細胞與細胞連接緊密，兩種細胞與支架材料間均形成連接結構。免疫組織化學檢測結果顯示構建的TE-pHC中HCE細胞和HCS細胞標志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白表達均呈陽性。上述結果表明構建的TE-pHC在組織結構上近似于人角膜后板層，HCE細胞和HCS細胞功能蛋白正常表達，具有發(fā)揮后板層生物學功能的潛能。
　　綜上所述，本文利用在體外擴增

16、培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細胞屬性正常，增殖能力旺盛的非轉(zhuǎn)染HCE細胞和HCS細胞，以光學性能優(yōu)良，組織結構和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似，生物相容性和機械力學性能良好的aPCS-DM為載體支架，經(jīng)體外構建5天后即可獲得形態(tài)組織結構和生物學性能與活體角膜后板層高度近似的TE-pHC，具有發(fā)揮其生物學功能的潛能。這些研究結果表明本實驗在體外成功構建的TE-pHC，既可作為體外角膜實驗的良好模型，又兼具后板層半角膜移植等效替代物的應用前景。T