組織工程人后板層半角膜體外構(gòu)建的實驗研究.pdf

1、角膜(Cornea)是位于眼球表面的一層透明組織，是維持正常視功能的重要結(jié)構(gòu)，由于位于眼表的最外層，因而極易受到損傷和感染，致使角膜病是引起視力下降甚至致盲的主要因素，目前主要依賴于角膜移植手術(shù)進(jìn)行治療。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國現(xiàn)有角膜病盲患者300余萬，均需要通過角膜移植進(jìn)行治療，但因捐獻(xiàn)角膜數(shù)量有限和供體角膜老化，每年能接受手術(shù)治療的患者只有1000余人，絕大多數(shù)患者因得不到可用的供體角膜而無法接受角膜移植和復(fù)明。目前，體外構(gòu)建的組

2、織工程角膜(Tissue-engineered human cornea)作為捐獻(xiàn)角膜的替代物，是解決供體角膜匱乏的主要途徑，已成為眾多角膜病盲患者重見光明的希望。組織工程角膜體外構(gòu)建的核心要素是種子細(xì)胞(Seeder cells)、載體支架（Carrier scaffold）和信號分子(Signalingmolecules)。組織工程角膜的體外構(gòu)建，要求種子細(xì)胞必須能夠持續(xù)保持細(xì)胞固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、旺盛的增殖能力、穩(wěn)定的遺傳性能和發(fā)揮固

3、有功能的潛能，要求載體支架必須具有與天然角膜類似的光學(xué)性能、三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)、生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度。獲得足量正常的種子細(xì)胞和生物相容性理想的的載體支架是開展組織工程角膜體外構(gòu)建研究的前提條件。
　　人角膜在組織結(jié)構(gòu)上由上皮層(Epithelium)、前彈力層(Bowman's membrane)、基質(zhì)層(Stroma)、后彈力層(Descemet' membrane)和內(nèi)皮層(Endothelium)構(gòu)成。其中，人角膜基質(zhì)(Human

4、 cornea stroma，HCS)由交錯排列的200-250個膠原板層結(jié)構(gòu)和散在分布的HCS細(xì)胞組成，占角膜厚度的90％，在角膜厚度和透明度維持中具有關(guān)鍵作用;而人角膜內(nèi)皮(Human cornea endothelium，HCE)位于角膜最內(nèi)層、由連接緊密的單層HCE細(xì)胞鑲嵌而成，是角膜和前房的天然屏障，通過泵-漏機(jī)制維持角膜透明度并為角膜供養(yǎng)/氧，在角膜厚度和透明度維持中具有決定性作用。在角膜受到深度創(chuàng)傷和感染時，往往會傷及深層

5、HCS和HCE，即后板層半角膜，輕者引起角膜水腫和角膜內(nèi)皮失代償，重者甚至致盲。目前后板層半角膜的治療方法主要是通過單層HCS和HCE的多次角膜移植手術(shù)，不僅增加了手術(shù)創(chuàng)傷和感染的風(fēng)險，而且在角膜愈合和移植瘢痕殘留方面也存在有諸多缺陷。因此，體外構(gòu)建出可用于移植的組織工程人后板層半角膜(Tissue-engineered posterior hemicornea，TE-pHC)已成為學(xué)者們新的研究熱點。本文研究目的就是利用本實驗室自主建

6、立的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCE細(xì)胞系和HCS細(xì)胞系作為種子細(xì)胞，以帶后彈力層的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine cornealstromata with Descemet' membrane，aPCS-DM)為載體支架，進(jìn)行TE-pHC的體外構(gòu)建研究，旨在獲得與活體角膜后半層組織結(jié)構(gòu)高度近似的TE-pHC。
　　為了獲得足量正常的TE-pHC種子細(xì)胞，本文首先對非轉(zhuǎn)染無致瘤性HCS和HCE組織細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行了體外

7、擴(kuò)增培養(yǎng)，并對其形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖活性、染色體屬性以及細(xì)胞標(biāo)志蛋白和功能蛋白的表達(dá)進(jìn)行了鑒定。光鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外擴(kuò)增培養(yǎng)的第1批65代HCE細(xì)胞形成匯合單層時呈多角形的六邊形內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài)，第28批63代HCS細(xì)胞形態(tài)呈梭型，仍然具有其原有細(xì)胞的形態(tài)特征;生長與增殖活性的檢測結(jié)果顯示，HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的群體倍增時間分別為48.54 h和38.28 h，仍保持有旺盛的體外增殖能力;染色體組型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種細(xì)胞的特征性染色體數(shù)目

8、均為2n=46條，仍具有人類染色體的特征;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞仍分別保持有HCE細(xì)胞標(biāo)志蛋白——人血管內(nèi)皮生長因子受體-2(FLK-1)和HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白——波形蛋白的陽性表達(dá)，表明兩種細(xì)胞仍保持有HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的固有屬性。對HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞功能蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCE細(xì)胞仍保持有細(xì)胞連接形成蛋白——緊密連接蛋白1(ZO-1)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白αv/β5

9、以及膜運輸?shù)鞍住狽a+/K+-ATPase的陽性表達(dá)，而HCS細(xì)胞保持有CX-43和整聯(lián)蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脫氫酶3(ALDH3)的陽性表達(dá)，證明這兩種細(xì)胞均仍然保持有形成細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間細(xì)胞連接和執(zhí)行膜運輸功能的潛能，且HCS細(xì)胞保持有抗紫外損傷的潛能。上述鑒定結(jié)果證明，第65代HCE細(xì)胞和第63代HCS細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細(xì)胞屬性正常，增殖能力旺盛，并依然保持有形成細(xì)胞連

10、接和執(zhí)行膜運輸功能的潛能，符合作為組織工程角膜種子細(xì)胞的各項條件，可以被用于TE-pHC體外構(gòu)建的種子細(xì)胞。
　　為了獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然角膜類似的TE-pHC載體支架，本文以新鮮豬角膜為材料進(jìn)行了aPCS-DM支架的制備和鑒定。我們利用凍融循環(huán)聯(lián)合核酸酶消化的方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，經(jīng)核黃素交聯(lián)及風(fēng)干處理，獲得了aPCS-DM載體支架。用于構(gòu)建TE-pHC前，分別對光學(xué)性能、組織結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和機(jī)械性能進(jìn)行了檢測和評價。光學(xué)性能檢測結(jié)

11、果顯示，aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜，具有良好的光學(xué)性能。組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，經(jīng)過脫細(xì)胞處理后aPCS膠原板層仍保持排列規(guī)則且結(jié)構(gòu)致密，后彈力層完整且表面平整，異種細(xì)胞在處理過程中被去除;理化性質(zhì)檢測結(jié)果顯示，含水量略高于天然角膜，aPCS中DNA殘留量低且符合醫(yī)用生物材料標(biāo)準(zhǔn)，糖胺聚糖分布與天然角膜相似。生物力學(xué)性能檢測結(jié)果顯示，aPCS在生物力學(xué)性能上與天然角膜無顯著差異。上述結(jié)果表明，本文制備的aPCS-DM支架具有良好

12、的光學(xué)性能，三維組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似，生物力學(xué)性能優(yōu)良，滿足作為構(gòu)建TE-pHC的載體支架材料的要求。
　　為了進(jìn)一步檢測載體支架與兩種細(xì)胞的生物相容性，本文對aPCS支架進(jìn)行了細(xì)胞毒性評價和接種細(xì)胞后的免疫組織化學(xué)檢測。利用HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性的檢測結(jié)果顯示，制備的aPCS無細(xì)胞毒性作用。接種HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞后aPCS的的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，細(xì)胞在載體支架內(nèi)部和后彈力層表面均能陽性表達(dá)

13、其標(biāo)志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白。上述結(jié)果綜合表明，aPCS支架不僅無細(xì)胞毒性，還能夠為細(xì)胞的黏附、增殖和功能表達(dá)提供合適的三維空間結(jié)構(gòu)，具備良好的生物相容性，是作為TE-pHC體外構(gòu)建的理想支架材料。
　　在已獲得種子細(xì)胞和載體支架的前提下，為了構(gòu)建具有功能的TE-pHC，本實驗進(jìn)行了TE-pHC的體外構(gòu)建并對其進(jìn)行了鑒定。本文通過比較HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的不同接種方式和摸索細(xì)胞接種時間建立了TE-pHC的構(gòu)建技術(shù)路線:微量

14、注射的方法將HCS細(xì)胞接種于aPCS支架的基質(zhì)中，培養(yǎng)24 h后將接種過HCS細(xì)胞的植片后彈力層面向上直接法接種HCE細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至4天，從而構(gòu)建出TE-pHC。對TE-pHC進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)和功能檢查，茜素紅染色結(jié)果說明HCE細(xì)胞在后彈力層面形成連續(xù)的單層，細(xì)胞密度為2910±420個/mm2的密度，相當(dāng)于健康成人30歲左右的內(nèi)皮細(xì)胞密度;H&E染色結(jié)果顯示HCS細(xì)胞在注射點附近支架黏附并伸展，向周圍擴(kuò)散分布，HCE細(xì)胞連續(xù)完整單層與后

15、彈力層結(jié)合緊密;TE-pHC的電鏡結(jié)果顯示，HCE細(xì)胞在aPCS后彈力層上形成的單層細(xì)胞表面平整，細(xì)胞與細(xì)胞連接緊密，兩種細(xì)胞與支架材料間均形成連接結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示構(gòu)建的TE-pHC中HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白表達(dá)均呈陽性。上述結(jié)果表明構(gòu)建的TE-pHC在組織結(jié)構(gòu)上近似于人角膜后板層，HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞功能蛋白正常表達(dá)，具有發(fā)揮后板層生物學(xué)功能的潛能。
　　綜上所述，本文利用在體外擴(kuò)增

16、培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細(xì)胞屬性正常，增殖能力旺盛的非轉(zhuǎn)染HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞，以光學(xué)性能優(yōu)良，組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似，生物相容性和機(jī)械力學(xué)性能良好的aPCS-DM為載體支架，經(jīng)體外構(gòu)建5天后即可獲得形態(tài)組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能與活體角膜后板層高度近似的TE-pHC，具有發(fā)揮其生物學(xué)功能的潛能。這些研究結(jié)果表明本實驗在體外成功構(gòu)建的TE-pHC，既可作為體外角膜實驗的良好模型，又兼具后板層半角膜移植等效替代物的應(yīng)用前景。T