體外構建血管化組織工程心肌的研究.pdf

1、目的：本研究用5-氮胞苷對獲取的大鼠骨髓間充質干細胞進行誘導，內皮生長培養(yǎng)基 MV2（EGM-2MV）對獲取的骨髓源性內皮祖細胞進行誘導，將誘導獲取的心肌細胞、內皮細胞以2:1比例混合種植于Matrigel基質膠上，進行組織工程心肌的血管化，以探索在體外進行血管化組織工程心肌構建的可能性。
　　方法：1、骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及誘導：利用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法分離獲取骨髓間充質干細胞；5-氮胞苷作為誘導劑，對其向心肌細胞進行定

2、向誘導。誘導前后，免疫細胞化學法行細胞鑒定：骨髓間充質干細胞表面標志物 CD29、CD44、CD34；心肌細胞表面標志物 cTnT。2、骨髓源性內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及向內皮細胞的誘導：取3周齡SD大鼠，分離出股骨、脛骨，等量淋巴細胞分層液分離，收集單個核細胞，通過 EGM-2MV條件培養(yǎng)基對骨髓源性內皮祖細胞進行培養(yǎng)。通過CD31、CD34和CD133等表面標志物的表達情況對細胞進行鑒定。3、體外構建組織工程化心?。簩⒐撬柙葱孕募〖毎?/p>

3、用DAPI標記、骨髓源性內皮細胞用 CM-dil標記，實驗組以2:1比例種植于 Matrigel基質膠并進行共同培養(yǎng)；對照組以1:0的比例進行種植培養(yǎng)。不同時間點觀察細胞復合體的形態(tài)，免疫熒光顯微鏡下和蘇木精-伊紅染色方法觀察兩種細胞的分布情況并進行心肌細胞凋亡檢測。采用 SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料選用均數±標準差（x±s）表示，組間對比采用t檢驗，P值<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：1、骨髓間充質干

4、細胞原代細胞接種后少數細胞貼壁，形狀不規(guī)則，可呈多種形態(tài)，如：紡錘形、不規(guī)則形；之后細胞形態(tài)不斷變化，最終呈集落樣增殖，細胞呈梭形并以放射狀或者漩渦狀形態(tài)向四周擴增。細胞傳代后，混合雜細胞被清除，骨髓間充質干細胞分布均勻，形態(tài)單一，呈長梭形，且增殖明顯高于原代細胞。骨髓間充質干細胞表面標記物CD29、CD44陽性表達，CD34陰性表達。即胞漿中有棕黃色顆粒為陽性表達，反之為陰性。2、P3代骨髓間充質干細胞生長狀況：接種第2天因胰酶消化作

5、用及適應新的生長環(huán)境細胞數稍有減少；第3天開始細胞數有所增長；到了第6天，細胞數明顯開始升高，說明此時細胞處于分裂增殖期；第9天時，細胞數達到最多。3、獲取的骨髓間充質干細胞在心肌細胞的定向誘導過程的初期（24h后）部分細胞因5-氮胞苷的毒性作用而死亡，經過1周的藥物誘導后可出現臨近細胞彼此融合；2周后，細胞呈圓柱形或多角形，細胞接觸緊密；4周后，細胞呈梭形，漩渦狀生長。誘導后細胞免疫組織化學染色顯示 cTnT陽性表達。通過細胞計數，確

6、定誘導后細胞的陽性率在90％以上。4、分離培養(yǎng)的大鼠骨髓源性內皮祖細胞接種后細胞逐漸貼壁，呈小桿狀或梭形等多種形態(tài)。5天時為集落樣生長：中央細胞密集，周圍單層細胞放射狀羅列，2周時多數單層細胞為多角形，融合成片狀，呈所謂“鋪路石樣”外觀。細胞免疫組織化學染色顯示 CD31、CD34和CD133陽性表達。通過細胞計數，確定誘導后細胞的陽性率在90%以上。5、第3代內皮細胞生長曲線：接種第2天因胰酶消化作用及適應新的生長環(huán)境細胞數未見增多，

7、48小時后貼壁伸展，3天后開始大量增殖，5天后進入對數生長期，細胞數明顯增多，8天以后增長趨勢逐漸減緩，趨于平穩(wěn)。6、蘇木精-伊紅染色及熒光顯微鏡顯示心肌內皮細胞/Matrigel基質膠復合體內細胞密度均勻，心肌細胞胞核呈藍色圓形熒光，內皮細胞胞漿呈紅色熒光。7、心肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)24h后，2:1組復合體可出現內皮細胞典型的“成血管現象”；1:0組可見細胞均勻生長，卻無“成血管現象”。8、TUNEL細胞凋亡檢測顯示2:1組比1:0

8、組的凋亡心肌細胞少。9、通過血管計數結果顯示，心肌內皮細胞/Matrigel基質膠組（12±2.69）形成的血管樣結構明顯多于心肌細胞/Matrigel基質膠組（1±0.79）。
　　結論：1、骨髓間充質干細胞經5-aza誘導可以獲得陽性率較高的心肌細胞。2、等量淋巴細胞分層液分離獲取骨髓源性內皮祖細胞并用 EGM-2MV條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可以獲得活性好、陽性率高的骨髓源性內皮細胞。3、骨髓源性心肌細胞與骨髓源性內皮細胞以2:1