構(gòu)建組織工程血管移植物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人們長期以來一直在尋求一種血管的最佳替代物，嘗試了自體動(dòng)靜脈、人工材料、生物材料等多種方法，但這些方法均存在一些不足。組織工程概念的提出及技術(shù)的逐步成熟使在體外培植具有生物活性，結(jié)構(gòu)、功能與自體血管相類似的人工血管成為可能。它標(biāo)志著醫(yī)學(xué)步入制造組織和器官的新時(shí)代，是生命科學(xué)發(fā)展史上的新的罩程碑。 本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞為種子細(xì)胞，制備了天然生物復(fù)合材料，對幾種生物材料的生物性能及細(xì)胞相容性進(jìn)行了研究，應(yīng)用組織工程的方

2、法，制造出組織工程補(bǔ)片并進(jìn)行了在體實(shí)驗(yàn)研究，同時(shí)，應(yīng)用模具直接成形，冷凍干燥等技術(shù)制備了管狀生物支架并應(yīng)用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)對細(xì)胞在管狀支架上的種植方法進(jìn)行了探索。 第一部分兔主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 目的：為構(gòu)建組織工程血管提供種子細(xì)胞。方法：兔麻醉后取下主動(dòng)脈，分別采用酶消化法和組織塊貼壁法培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞并傳代，倒置顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察和免疫組化鑒定。結(jié)果：成功的培養(yǎng)出血管內(nèi)皮細(xì)胞和平

3、滑肌細(xì)胞并傳代。倒置顯微鏡下血管內(nèi)皮細(xì)胞呈“鵝卵石”形態(tài)，平滑肌細(xì)胞典型的“峰一谷”狀，透射電鏡內(nèi)皮細(xì)胞特征性W-P小體，平滑肌細(xì)胞大量肌絲，免疫組化內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子(+)，平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白抗體(+)。結(jié)論：所培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞為組織工程血管的研究提供了細(xì)胞來源。 第二部分組織工程支架材料的制備與生物學(xué)性能檢測 目的：制備復(fù)合天然生物支架材料膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠/殼聚糖膜，并評估膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠／殼聚

4、糖膜和明膠海綿(由PfizercorporationUSA提供)這三種材料的生物學(xué)性能及組織相容性。方法：1．應(yīng)用材料復(fù)合交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠／殼聚糖膜，光鏡，掃描電鏡觀察膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠／殼聚糖膜、明膠海綿。2．應(yīng)用萬能測試機(jī)測定膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠／殼聚糖膜、明膠海綿的力學(xué)性能，包括韌性指標(biāo)和抗張強(qiáng)度，測定材料吸水率和接觸角。3．在體外應(yīng)用膠原酶，溶菌酶和去離子水測定體外降解特性，將支架材料種植于兔皮下，

5、進(jìn)行皮下包埋實(shí)驗(yàn)，分別在2周、4周、6周、8周和12周光學(xué)顯微鏡觀察，評價(jià)材料在體內(nèi)的降解情況和組織相容性。結(jié)果：1．成功制備了膠原／透明質(zhì)酸膜和明膠／殼聚糖膜，光鏡，電鏡下觀察三種材料均具有網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，膠原／透明質(zhì)酸膜和明膠／殼聚糖膜孔徑均勻，明膠海綿結(jié)構(gòu)排列較不規(guī)則；2．三種材料的吸水率均較好，接觸角均小于900；3．膠原／透明質(zhì)酸膜具有較好的韌性和抗張強(qiáng)度，明膠／殼聚糖次之，明膠海綿的力學(xué)性能不夠理想；4．膠原／透明質(zhì)酸膜主要被膠

6、原酶分解，明膠／殼聚糖膜在溶菌酶中降解，明膠海綿在去離子水中容易得到水相而降解；三種材料在體內(nèi)的降解均符合生物材料的組織反應(yīng)過程，具有良好的組織相容性，膠原／透明質(zhì)酸膜在體內(nèi)12周可完全降解，明膠／殼聚糖膜約為8周，明膠海綿約6周。結(jié)論：1．應(yīng)用材料復(fù)合交聯(lián)的方法制備的生物材料膠原／透明質(zhì)酸膜，明膠／殼聚糖膜和Pfizer公司提供的明膠海綿均具有一定的多微孔結(jié)構(gòu)，為種子細(xì)胞的粘附提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；2．三種材料在體內(nèi)，體外均可以維持一定的結(jié)

7、構(gòu)穩(wěn)定，并可以逐漸降解，具有良好的生物相容性；3．膠原／透明質(zhì)酸膜和明膠／殼聚糖膜具有較好的生物學(xué)性能，其中，膠原／透明質(zhì)酸膜力學(xué)性能更優(yōu)，為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了材料學(xué)基礎(chǔ)；明膠海綿的力學(xué)性能較不理想；4．本實(shí)驗(yàn)研究為未來支架材料的研究提供了必要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。 第三部分組織工程血管生物支架材料細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞與膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠/殼聚糖膜、明膠海綿的細(xì)胞相容性，為構(gòu)建組織工程血管提

8、供實(shí)驗(yàn)參數(shù)，篩選出最適合于構(gòu)建組織工程血管的支架材料。方法：1．細(xì)胞種植的方法和檢測：采用兩步法進(jìn)行細(xì)胞種植，先將血管平滑肌細(xì)胞種植在材料上，反復(fù)接種3次，每次間隔24小時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)2周后再將內(nèi)皮細(xì)胞接種在平滑肌細(xì)胞一生物材料復(fù)合體上，接種2次，間隔24小時(shí)，培養(yǎng)5天，構(gòu)建片狀組織工程材料，分別于培養(yǎng)第7天，14天及接種內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)7天時(shí)取出材料HE染色和掃描電鏡觀察；2．應(yīng)用WST-1法測定平滑肌細(xì)胞與材料的粘附率，應(yīng)用WST-1測定

9、平滑肌細(xì)胞在材料上的增殖力；3．應(yīng)用WST-1法測定細(xì)胞接種不同階段的成活和增殖力；4．應(yīng)用3H-TDR摻入法測定DNA合成率；5．將三種材料的細(xì)胞粘附、增殖和代謝以及鏡下形態(tài)觀察情況進(jìn)行對比。結(jié)果：1．光鏡和掃描電鏡觀察顯示種子細(xì)胞在三種材料上均隨著培養(yǎng)時(shí)間，接種次數(shù)增加而生長加快，其中膠原／透明質(zhì)酸膜和明膠／殼聚糖膜上的細(xì)胞生長更好，細(xì)胞連接更致密；2。WST-l法測定結(jié)果表明：膠原／透明質(zhì)酸膜與平滑肌細(xì)胞的粘附率最高，細(xì)胞的增殖和

10、代謝狀況較好，明膠／殼聚糖膜次之，而明膠海綿的細(xì)胞粘附和增殖率相對較低；3．WST一1測定表明細(xì)胞在材料上的生長隨著接種次數(shù)的增加有不同程度的提高；4．3H-TDR摻入法測定DNA合成率結(jié)果表明細(xì)胞在膠原／透明質(zhì)酸膜上的DNA合成最高，明膠／殼聚糖膜次之，明膠海綿第三。結(jié)論：L采用平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞分層種植的方法成功構(gòu)建了片狀組織工程材料；2．采用適當(dāng)間隔、反復(fù)接種的方法可以提高細(xì)胞的粘附和增殖；3．構(gòu)建的生物材料膠原／透明質(zhì)酸膜和明

11、膠／殼聚糖膜具有較理想的細(xì)胞相容性，其中膠原／透明質(zhì)酸膜細(xì)胞相容性更好；4．本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的膠原／透明質(zhì)酸和明膠／殼聚糖組織工程材料為下一步實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第四部分組織工程補(bǔ)片修補(bǔ)兔腹主動(dòng)脈缺損的初步實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證我們構(gòu)建的片狀組織工程材料能否在體內(nèi)承受循環(huán)系統(tǒng)的壓力，種植的細(xì)胞能否經(jīng)受血流的沖刷并在體內(nèi)最終形成工程化血管組織，并對生物材料的血液相容性進(jìn)行評價(jià)。方法：1．膠原／透明質(zhì)酸膜、種植細(xì)胞

12、的膠原／透明質(zhì)酸膜，明膠／殼聚糖膜及種植細(xì)胞的明膠／殼聚糖膜進(jìn)行血小板凝集實(shí)驗(yàn)和生物材料溶血實(shí)驗(yàn)；2．按前一部分的細(xì)胞種植方法構(gòu)建片狀組織工程材料，并在內(nèi)皮細(xì)胞種植后加入BrdU進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記；3．將構(gòu)建的片狀組織工程材料膠原／透明質(zhì)酸膜、明膠／殼聚糖膜進(jìn)行兔腹主動(dòng)脈缺損修補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為膠原／透明質(zhì)酸膜組和明膠／殼聚糖膜組，每組各分實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組為種植了平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的片狀組織工程材料，對照組為未種植細(xì)胞的空白材料，腹部切

13、口，暴露腹主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈水平以下上下阻斷腹主動(dòng)脈，縱行切開腹主動(dòng)脈前壁8mm，將裁減好的材料連續(xù)縫合于人造腹主動(dòng)脈缺損上，觀察術(shù)后兔腹主動(dòng)脈情況和動(dòng)物生活狀況，分別在術(shù)后3天、一周、2周、4周取出補(bǔ)片，應(yīng)用光鏡，掃描電鏡，BrdU細(xì)胞標(biāo)記法，免疫組化鑒定方法觀察組織工程補(bǔ)片材料在體實(shí)驗(yàn)后的情況。結(jié)果：1．膠原／透明質(zhì)酸膜，明膠／殼聚糖膜的溶血率均小于5％，符合醫(yī)用生物材料的要求；種植內(nèi)皮細(xì)胞的生物材料比未種植內(nèi)皮細(xì)胞的材料的血小板聚集

14、率低；2．明膠／殼聚糖膜未能承受腹主動(dòng)脈壓力，沒有度過觀察期，解剖發(fā)現(xiàn)見所移植材料處有破損，腹腔內(nèi)大量出血死亡；3．膠原／透明質(zhì)酸膜組手術(shù)過程基本順利，實(shí)驗(yàn)組和對照組各l例術(shù)中出現(xiàn)吻合不當(dāng)致吻合口出血死亡，對照組2例術(shù)后出現(xiàn)雙下肢癱瘓后死亡，解剖發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈內(nèi)大量血栓，其余均安全存活至觀察期末，各觀察期末解剖實(shí)驗(yàn)組見動(dòng)脈腔內(nèi)光滑，無肉眼血栓形成，補(bǔ)片內(nèi)側(cè)有內(nèi)膜樣組織形成，材料表面凹陷，而空白對照組補(bǔ)片內(nèi)側(cè)表面粗糙，僅在與自體動(dòng)脈接觸的部

15、位有內(nèi)膜樣組織形成，部分有少量血栓形成；HE染色，掃描電鏡檢測表明實(shí)驗(yàn)組組織工程補(bǔ)片內(nèi)側(cè)內(nèi)膜完整，表面有較完整的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，免疫組化鑒定Ⅷ因子陽性，肌動(dòng)蛋白抗體陽性，而對照組內(nèi)膜不完整，結(jié)構(gòu)雜亂，無內(nèi)皮細(xì)胞樣組織存在，免疫組化鑒定Ⅷ因子陰性，BrdU細(xì)胞標(biāo)記顯示在實(shí)驗(yàn)組材料組織中有我們標(biāo)記的細(xì)胞存在。結(jié)論：L構(gòu)建的組織工程膠原／透明質(zhì)酸膜具有一定的抗凝功能和抗張強(qiáng)度，基本可耐受腹主動(dòng)脈的血流沖擊，種植的細(xì)胞經(jīng)過血流的沖刷，管腔仍通

16、暢，在體內(nèi)形成了一定意義的組織工程血管樣組織，說明本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，材料構(gòu)建，細(xì)胞種植方法和工程組織成熟等技術(shù)是可行的，但其力學(xué)強(qiáng)度和血液相容性尚不完美，有待于進(jìn)一步完善，另外，更長期的隨訪觀察是必需的；2．明膠／殼聚糖膜不能耐受動(dòng)脈的壓力，材料的力學(xué)性能需要得到較大的提高。 第五部分組織工程管狀支架的制備及動(dòng)態(tài)培養(yǎng)在血管組織工程中的應(yīng)用研究 目的：對如何構(gòu)建管狀支架的方法進(jìn)行研究，將動(dòng)態(tài)培養(yǎng)裝置應(yīng)用在管狀支架細(xì)胞種植過程中

17、，尋找一種好的體外構(gòu)建組織工程血管的方法。方法：1．制備管狀支架模具，采用模具成形，冷凍干燥等技術(shù)，將膠原和透明質(zhì)酸在體外預(yù)構(gòu)管狀支架；2．自行設(shè)計(jì)和制作動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)裝置；3．以兔的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，在膠原／透明質(zhì)酸構(gòu)成的管狀支架上先后種植，應(yīng)用WST-1測定細(xì)胞的增殖情況，掃描電鏡觀察細(xì)胞種植的形態(tài)，比較靜態(tài)和動(dòng)態(tài)種植培養(yǎng)方法的細(xì)胞生長情況。結(jié)果： 1．運(yùn)用模具成形，冷凍干燥技術(shù)成功制備了管狀血管支架，具