人骨髓來源干細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程血管實驗研究.pdf

1、目的： 1．研究人骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的可行性。 2．研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)為血管平滑肌細(xì)胞的可行性。 3．研究由人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來源的血管平滑肌細(xì)胞復(fù)合PGA材料支架，在血管生物反應(yīng)器搏動環(huán)境下構(gòu)建組織工程小口徑血管的可行性。 方法： 1.人骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究：抽取健康成人志愿者骨髓5ml，經(jīng)密度梯度離心分離得單個核細(xì)胞。將單個核細(xì)胞貼壁

2、培養(yǎng)于纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）包被的培養(yǎng)皿中，12小時后更換培養(yǎng)液，低血清（2％）DMEM-LG培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞60％融合后消化傳代。傳代前，F(xiàn)ACS分析原代細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）標(biāo)志CD133、CD34、Flk-1表達(dá)情況。第一代細(xì)胞用于誘導(dǎo)分化實驗，分誘導(dǎo)組和對照組。誘導(dǎo)組采用EGM-2(含2％FBS)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組仍用DMEM-LG（含有10％FBS）培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)至14天，倒置相差顯微鏡下觀察

3、細(xì)胞形態(tài)改變；免疫熒光、RT-PCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31、VE cadherin、Flk-1表達(dá)情況；FACS分析細(xì)胞誘導(dǎo)陽性率；細(xì)胞攝取DiI-ac-LDL的實驗檢測內(nèi)皮細(xì)胞功能。 2．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究：抽取健康成人志愿者骨髓5ml，經(jīng)密度梯度離心分離得單個核細(xì)胞，DMEM-LG（含10％FBS）培養(yǎng)液中培養(yǎng)。60％融合后傳代，第一代細(xì)胞用于實驗。實驗PDGF-BB(Plateletde

4、rivedgrowthfactor-BB,PDGF-BB）誘導(dǎo)組與無PDGF-BB組（對照組）兩組。誘導(dǎo)組培養(yǎng)液為添加誘導(dǎo)因子PDGF-BB（20ng/ml）的EGM-2培養(yǎng)液，對照組培養(yǎng)液為EGM-2培養(yǎng)液。誘導(dǎo)14天，倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；免疫熒光、RT-PCR、Western-Blot方法檢測血管平滑肌細(xì)胞特異標(biāo)志（SM ɑ-actin、SMMHC、SM calponin和SM 22ɑ）的表達(dá)情況；FACS檢測

5、細(xì)胞誘導(dǎo)陽性率。 3．HBMSCs來源的VSMCs復(fù)合PGA支架，在搏動環(huán)境下體外構(gòu)建小口徑血管的實驗：HBMSCs誘導(dǎo)得的VSMCs以50×106/ml的濃度接種于無紡PGA纖維支架，培養(yǎng)于添加PDGF-BB（20ng/ml）的DMEM-LG（含10％FBS）培養(yǎng)液中。培養(yǎng)兩周后，將細(xì)胞材料復(fù)合物移至血管生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分如前。分搏動組和靜態(tài)組。搏動組處于搏動環(huán)境下，搏動頻率由低頻（60次/min）到高頻（165

6、次/min），管道流量由低流量（250ml/min）到高流量（450ml/min）遞增，每日工作12小時，靜態(tài)組無搏動刺激。培養(yǎng)6周后取材，大體觀察構(gòu)建血管的形態(tài)、顏色、彈性。掃描電鏡（SEM）觀察構(gòu)建血管內(nèi)外壁情況。組織學(xué)檢測構(gòu)建血管細(xì)胞生長增殖及基質(zhì)分泌情況。 結(jié)果： 1. 人骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成內(nèi)皮細(xì)胞的實驗研究：原代細(xì)胞FACS分析CD133、CD34、CD31、VE cadherin、Flk－

7、1表達(dá)率分別為56.21±10.22％、57.72±12.12％、2.11±1.13％、1.06±2.10％、36.88±6.71％。誘導(dǎo)組細(xì)胞誘導(dǎo)至14天，細(xì)胞生長呈“鋪路石”樣外觀，細(xì)胞免疫熒光檢測示CD31、vWF、VE cadherin、Flk-1表達(dá)陽性；FACS分析示誘導(dǎo)組CD133、CD34、CD31、VE cadherin、Flk－1表達(dá)率分別為3.27±1.56％、9.91±8.71％、75.23±10.17％、59.

8、80±10.21％、70.11±13.32％，而對照組表達(dá)率為14.65±5.03％、20.17±11.68％、4.07±2.13％、1.01±2.45％、3.12±1.23％。細(xì)胞誘導(dǎo)前后CD133、CD34、CD31、 VE cadherin表達(dá)有顯著性差異。誘導(dǎo)組與對照組CD31、VE cadherin、Flk-1表達(dá)也有顯著性差異；誘導(dǎo)組細(xì)胞可攝取DiI-ac-LDL，表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞具備分化成熟內(nèi)皮細(xì)胞功能。 2．人骨

9、髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗：HBMSCs 在PDGF-BB(20ng/ml)誘導(dǎo)作用下，誘導(dǎo)14天，細(xì)胞生長呈現(xiàn)VSMCs所特有的“波峰－波谷”生長模式，并表達(dá)SM-actin， SM calponin， SMMHC， SM 22α等血管平滑肌標(biāo)記，而對照組細(xì)胞生長未呈現(xiàn)“波峰－波谷”形態(tài)，不表達(dá)血管平滑肌標(biāo)志；FACS分析檢測誘導(dǎo)組SM -actin， SM calponin， SMMHC表達(dá)陽性率，分別為57.93

10、±3.22％、43.66±4.22％、49.73±2.79％。而對照組FACS檢測SM-actin， SM calponin， SMMHC表達(dá)陽性率分別為4.89±0.23％、6.00±0.84％、6.70±2.45％。誘導(dǎo)組與對照組細(xì)胞表達(dá)陽性率有顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3．HBMSCs來源的VSMCs復(fù)合PGA支架，在搏動環(huán)境下體外構(gòu)建小口徑血管的實驗：由hBMSCs誘導(dǎo)來的VSMCs復(fù)合PGA膜片，在體外培養(yǎng)皿中培養(yǎng)

11、2周時，倒置相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞與支架材料相容性良好，分泌基質(zhì)旺盛。隨后置于血管生物反應(yīng)器中，處于搏動環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)6周取材，大體觀察示構(gòu)建血管形態(tài)良好、色澤粉紅、彈性好。SEM觀察示細(xì)胞伸展融合，內(nèi)外壁平滑無裂隙。構(gòu)建血管壁HE染色證實細(xì)胞排列緊密、分泌大量基質(zhì)，Massons染色示有大量膠原成分形成，免疫組化染色表達(dá)平滑肌特異標(biāo)記SM ɑ-actin。而靜態(tài)組構(gòu)建血管也可形成管形結(jié)構(gòu)，但是管壁厚薄不均，彈性差。SEM觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)外壁細(xì)胞

12、未完全伸展融合，有裂隙存在。通過HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞排列紊亂、分泌基質(zhì)少，Massons染色示細(xì)胞膠原分泌少，免疫組化染色未見平滑肌標(biāo)志SM ɑ-actin表達(dá)。 結(jié)論 1. 人骨髓用密度梯度離心方法得到單個核細(xì)胞，經(jīng)FN差速貼壁能夠分離得到內(nèi)皮祖細(xì)胞,表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志。在體外經(jīng)EGM-2誘導(dǎo)可呈現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志，并且具有內(nèi)皮細(xì)胞功能，可以成為血管組織工程內(nèi)皮細(xì)胞來源； 2．HBMSCs經(jīng)體