人脂肪來源干細胞復合聚乙二醇修飾的纖維蛋白凝膠體外構建組織工程血管的實驗研究.pdf

1、干細胞及組織工程研究的深入進行為機體缺損組織的修復治療提供新的、有效的途徑和策略。然而目前研發(fā)的組織工程產品在體內應用研究時，其厚度都必須小于2毫米。一旦超過此厚度將直接影響營養(yǎng)物質和氧氣向植入細胞的輸送，包括組織工程心肌、肝、脂肪以及平滑肌組織的研發(fā)和應用，均受限于組織厚度而難以有效發(fā)揮生物學功能。較大體積(直徑>1厘米)的復合植入物不僅依靠受體營養(yǎng)物質擴散，細胞功能的正常發(fā)揮還必須借助于良好血運的支持。構建組織工程血管尤其是微血管網

2、成為人工組織、器官產品能否有效發(fā)揮生物學功能的關鍵問題之一。人脂肪干細胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)已被證實具有向血管內皮細胞在內的多種組織細胞分化的潛能并初步用于組織工程和再生醫(yī)學應用研究；纖維蛋白凝膠因其良好的生物相容性被視為組織工程的良好支架材料來源。本課題研究擬采用聚乙二醇修飾劑優(yōu)化纖維蛋白凝膠特性，將hADSCs與修飾后的纖維蛋白凝膠復合，觀察體外構建組織工程微血管的可行性

3、，為組織器官的體外構建及生物學功能的發(fā)揮提供相關實驗依據(jù)。 研究目的: 1、建立并優(yōu)化體外纖維蛋白凝膠復合hADSCs后向血管內皮細胞(BVEC)誘導分化的技術方法，并進行生物學性狀鑒定。 2、優(yōu)化PEG對纖維蛋白原的修飾條件并對纖維蛋白凝膠相關特性改變進行鑒定。 3、明確聚乙二醇修飾后的纖維蛋白凝膠對于復合的hADSCs向血管內皮細胞誘導分化有無影響。 研究方法: 1、通過吸脂手術得到正

4、常人脂肪組織，經膠原酶消化和貼壁培養(yǎng)方法獲得hADSCs。通過形態(tài)學觀察、表面標志物檢測、向脂肪細胞、血管內皮細胞誘導分化等檢測和分析生物學特性。 2、取P3代hADSCs，同纖維蛋白原溶液混合后加入凝血酶，制成凝膠。加入血管內皮細胞誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)。按照不同細胞種植密度和纖維蛋白原濃度分組觀察來優(yōu)化培養(yǎng)條件。通過觀察細胞形態(tài)改變，了解其生長狀態(tài)；HE染色觀察凝膠內細胞生長狀態(tài)；掃描電鏡和透射電鏡觀察凝膠內誘導細胞結構。

5、 3、甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基碳酸酯(mPEG—sc)和聚乙二醇琥珀酰亞胺基碳酸酯(sc-PEG—sc)對于纖維蛋白原的平均修飾度測定。通過TNBS法和SDS-PAGE法測定不同修飾配比度和反應溫度下的纖維蛋白原的聚乙二醇化平均修飾度變化。觀察修飾后纖維蛋白凝膠性狀變化，包括：成膠時間、成膠率、BCA法測定抗酶降解能力(纖維蛋白溶解酶、膠原酶)及電鏡下凝膠超微結構。 4、取P3代hADSCs，常規(guī)胰酶消化，計數(shù)后同聚乙二醇修

6、飾后的纖維蛋白原溶液混合后加入凝血酶，制成凝膠。加入血管內皮細胞誘導培養(yǎng)基，每2天更換一次。通過觀察細胞生長形態(tài)和測定細胞生長曲線了解其生長狀態(tài)；RT-PCR鑒定誘導后的血管內皮細胞特異性基因表達。 實驗結果: 1、hADSCs呈長梭形，旋渦狀排列生長。流式細胞儀檢測hADSCs表面標志：CD34、CD45(造血干細胞的特異性表面標志)和Flk—1(內皮細胞表面標志)表達陰性；CD29、CD44(粘附分子)、CD90及C

7、D105(轉化生長因子受體)，表達陽性CD71(轉鐵蛋白受體)僅有微弱表達。在一定誘導培養(yǎng)條件下，可以向脂肪細胞誘導分化。 2、在特定誘導培養(yǎng)條件下，hADSCs可以向血管內皮細胞誘導分化：誘導后4d開始發(fā)生形態(tài)改變，長梭形細胞逐漸縮短轉為橢園形：誘導第8天細胞出現(xiàn)多邊形，增殖明顯。誘導第12天細胞增殖達到高峰，密度大，局部呈現(xiàn)“鵝卵石”樣排列細胞。免疫組化和熒光染色證實有vWF、Flk—1、CD31、CD34、等血管內皮細胞特

8、異性標記物表達。RT-PCR結果顯示誘導第7天的hADSCs表達血管內皮細胞特異性基因包括CD31、CD34和VE—cadherin。 3、纖維蛋白凝膠由纖維蛋白原溶液加入凝血酶作用后形成。其強度同纖維蛋白原濃度呈正相關。脂肪干細胞按照不同細胞密度種植在2mg/ml的纖維蛋白凝膠后向血管內皮細胞持續(xù)誘導。細胞在凝膠內呈現(xiàn)立體生長方式，誘導第2天細胞由梭形條索狀轉為星芒狀，誘導第6天開始出現(xiàn)相鄰細胞之間接觸形成管狀結構，誘導第8天

9、細胞生長形成明顯管網狀結構，誘導第12天管網狀結構密度達到高峰。隨著種植的細胞密度增加(0.5～2.0×105/ml)，細胞形成的立體管網密度明顯增大，而隨著纖維蛋白原濃度增加(2.5mg/ml～10mg/ml)，細胞形成的立體管網密度逐漸減少。復合材料經HE染色后可見hADSCs立體誘導培養(yǎng)后在凝膠內形成的管網狀結構。通過掃描電鏡可見纖維蛋白凝膠內出現(xiàn)一些血管內皮細胞生長所特有的管狀結構。透射電鏡可見細胞內出現(xiàn)內皮細胞特有的Weibl

10、e-Palade小體和細胞構成的管腔樣結構。 經TNBS法和SDS-PAGE法測定，mPEG—sc和sc-PEG—sc對于纖維蛋白原的平均修飾率隨著修飾劑用量和反應溫度上升而逐漸增大。隨著mPEG—sc和sc-PEG—sc用量摩爾配比度的上升，纖維蛋白原成膠率逐漸下降，纖維蛋白原成膠時間逐步增加，而凝膠的穩(wěn)定性逐漸下降。成膠反應溫度升高可減少成膠時間，但對于形成的凝膠穩(wěn)定性無影響。纖維蛋白原在mPEG—sc低配比度條件下(10：

11、1)，纖維蛋白凝膠抗膠原酶降解能力增強，但配比度從25增至100時，抗膠原酶降解能力逐漸減弱。在sc-PEG—sc配比度10：1、25：1和50：1條件下，纖維蛋白凝膠抗膠原酶降解能力增強，配比度增至100：1時，抗膠原酶降解能力明顯減弱。不同濃度的纖維蛋白原溶液形成的纖維蛋白凝膠，經電鏡觀察發(fā)現(xiàn)20mg/ml濃度的凝膠內纖維蛋白交聯(lián)后形成的支架孔徑小于10mg/ml的凝膠材料。20mg/ml濃度纖維蛋白原溶液經mPEG—sc和sc-P

12、EG—sc按照50：1和100：1修飾后發(fā)現(xiàn)相比未修飾的凝膠，支架孔徑逐漸縮小，但是隨著修飾度的上升，材料內支架密度下降。同樣配比度修飾條件下50：1，sc-PEG—sc—Fn材料孔徑小于mPEG—sc—Fn材料。 4、通過生長曲線觀察到hADSCs在聚乙二醇(mPEG—sc和sc-PEG—sc)修飾后的凝膠內增殖速度無差異，三組細胞生長曲線形態(tài)相似。向血管內皮細胞誘導觀察發(fā)現(xiàn)各組細胞生長良好，都出現(xiàn)立體管網狀生長，管網密度相似

13、，無明顯差別。RT-PCR顯示誘導5天后纖維蛋白原凝膠組和sc-PEG—sc組表達CD31、CD34、VE—cadherin和KDR；mPEG—sc修飾組表達CD31、CD34和KDR。 結論: 1、hADSCs在體外可穩(wěn)定傳代，并具有多向分化能力。體外經誘導后可向血管內皮細胞分化，并表達特異性標記。 2、hADSCs同纖維蛋白凝膠復合后以三維立體方式向血管內皮細胞誘導，在表達血管內皮細胞特異性標記同時凝膠內出現(xiàn)

14、立體管網狀結構。 3、證實了聚乙二醇修飾劑對于纖維蛋白原修飾的可行性。優(yōu)化聚乙二醇修飾反應條件的同時，明確了纖維蛋白凝膠生物特性的改變。纖維蛋白凝膠的聚乙二醇化能有效改善纖維蛋白作為細胞支架材料的生物特性，有利于體外血管構建方法的完善和體內應用研究。 4、聚乙二醇化的纖維蛋白凝膠不影響hADSCs誘導、分化及血管內皮細胞網狀結構的形成。該方法優(yōu)化了纖維蛋白凝膠作為組織工程微血管構建材料的部分功能，為今后完善組織工程微血管