滑膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合水凝膠支架材料體外構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺損常見于關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎，缺損不能自我修復(fù)，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)其它組織(半月板，交叉韌帶)的進(jìn)一步損害，最終使關(guān)節(jié)功能喪失，目前，無理想的治療辦法。近年來，隨著干細(xì)胞和生物材料研究水平的不斷提高，組織工程在關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中扮演著越來越重要的角色。
　　 組織工程就是在體外模擬體內(nèi)環(huán)境，利用種子細(xì)胞復(fù)合生物支架材料體外構(gòu)建人體組織或者器官，再移植到體內(nèi)，從而達(dá)到治療和修復(fù)組織或者器官的目的。目前，在組織工程關(guān)節(jié)軟骨研究領(lǐng)域里

2、，研究熱點(diǎn)主要包括三個(gè)方面：(1)種子細(xì)胞，(2)生物支架材料，(3)培養(yǎng)環(huán)境。種子細(xì)胞主要包括軟骨細(xì)胞、胚胎組織來源的干細(xì)胞和成體組織來源的干細(xì)胞。軟骨細(xì)胞是研究最廣泛的一種種子細(xì)胞。軟骨細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，體外擴(kuò)增能力有限，容易發(fā)生去分化，并且來源有限。鑒于倫理方面的考慮，胚胎干細(xì)胞目前還不能廣泛應(yīng)用于組織工程關(guān)節(jié)軟骨的研究。成體組織來源的干細(xì)胞擁有來源廣泛、容易體外培養(yǎng)和自我增殖等優(yōu)點(diǎn)。在組織工程關(guān)節(jié)軟骨中，成體干細(xì)胞被認(rèn)為是一

3、種非常有前途的種子細(xì)胞。當(dāng)前，已經(jīng)成功地從成體組織分離出的干細(xì)胞有骨髓組織來源的干細(xì)胞、脂肪組織來源的干細(xì)胞、骨膜組織來源的干細(xì)胞和肌肉組織來源的干細(xì)胞等。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，許多學(xué)者認(rèn)為相關(guān)聯(lián)組織來源的干細(xì)胞對(duì)人體組織的工程化修復(fù)可能有更大的潛能。人體膝關(guān)節(jié)腔被整個(gè)滑膜組織所包裹，滑膜組織相連接于關(guān)節(jié)軟骨組織，并且能夠分泌大量的關(guān)節(jié)液，營(yíng)養(yǎng)和潤(rùn)滑整個(gè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)相關(guān)聯(lián)的組織(關(guān)節(jié)軟骨組織，半月板組織)。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，從關(guān)節(jié)滑膜組

4、織中成功分離出間充質(zhì)干細(xì)胞?；そM織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用在組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，已經(jīng)受到越來越多學(xué)者的重視。除了干細(xì)胞，生物支架材料是另外一個(gè)非常重要因素影響關(guān)節(jié)軟骨組織工程的修復(fù)。當(dāng)前，生物支架材料研究主要包括天然支架材料和人工合成支架材料。水凝膠支架材料屬于一種特殊人工合成支架材料，以其高含水性、可塑性和高細(xì)胞相容性，被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究領(lǐng)域。管滑膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨組織工程修復(fù)研究領(lǐng)域里已經(jīng)有一些相

5、關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，但是對(duì)其生物學(xué)特性和復(fù)合水凝膠支架材料后的關(guān)節(jié)軟骨分化潛能，仍然存在許多未知問題。本課題主要從干細(xì)胞和生物支架材料兩方面來研究滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合水凝膠支架材料體外構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨組織。課題研究了滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性(細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞增殖性，細(xì)胞多向分化潛能)。課題還設(shè)計(jì)和合成了兩種新穎的水凝膠支架材料(可注射的Gellan水凝膠和可降解的PhosPEG水凝膠)作為滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維細(xì)胞載體。本研究分為三個(gè)部分

6、。
　　 第一章：兔來源的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 細(xì)胞從兔來源的滑膜組織分離后，貼壁培養(yǎng)一段時(shí)間。我們采用細(xì)胞克隆形成和多向分化潛能兩種方法分析兔滑膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　 ⑴新鮮分離的兔來源滑膜干細(xì)胞體外培養(yǎng)7天后，顯微鏡下觀察它們有成纖維細(xì)胞形態(tài)。取第一代滑膜干細(xì)胞稀釋種植到細(xì)胞培養(yǎng)皿上，體外培養(yǎng)兩周左右，顯微鏡下觀察有細(xì)胞克隆形成。體外繼續(xù)培養(yǎng)三周左右，晶紫蘭染

7、色，顯微鏡下觀察有許多大于2mm的細(xì)胞克隆形成。
　　 ⑵取第四代的滑膜干細(xì)胞進(jìn)行多向分化潛能分析。①軟骨組織分化：體外誘導(dǎo)21天后，阿爾新藍(lán)染色顯示有軟骨基質(zhì)形成。②成骨組織分化：體外誘導(dǎo)14天后，茜素紅染色顯示有大量鈣質(zhì)形成。③脂肪組織分化：體外誘導(dǎo)14天后，油紅染色顯示有脂肪小滴形成。
　　 小結(jié)：兔滑膜組織來源的干細(xì)胞表現(xiàn)出間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性：①成纖維狀細(xì)胞形態(tài)，②自我增殖能力，③多向分化潛能(軟骨，成骨，

8、脂肪)。
　　 第二章：滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合光聚合水凝膠支架材料向關(guān)節(jié)軟骨分化。
　　 兔滑膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合兩種光聚合水凝膠(PEGDA，PhosPEG)后，在三種不同軟骨誘導(dǎo)液(無生長(zhǎng)因子，TGFβ1,TGFβ3)誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。我們用Live-Dead Assay、WST-1 Assay、 Biochemical Assay、Real-time RT-PCR和Immunohistochemistry五種方

9、法分析滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合兩種光聚合水凝膠支架材料體外向關(guān)節(jié)軟骨組織分化的能力。
　　 ⑴Live-Dead Assay顯示滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在兩種光聚合水凝膠里，都保持較高的細(xì)胞活性。在TGFβ1誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組，WST-1 Assay顯示滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在PEGDA水凝膠里的細(xì)胞增殖能力大于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在可降解PhosPEG水凝膠里。相反，在TGFβ3誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在兩種光聚合水凝膠中的細(xì)胞增殖能力沒有

10、明顯區(qū)別。
　　 ⑵在所有的實(shí)驗(yàn)組里，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在兩種光聚合水凝膠里都實(shí)現(xiàn)了向關(guān)節(jié)軟骨組織分化。相比較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，Real time RT-PCR和BiochemicalAssay分析表明實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因和蛋白(Collagen typeⅡ和Aggrecan)的表達(dá)都明顯增高。另外，相比較PEGDA實(shí)驗(yàn)組，PhosPEG實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)都明顯降低，但免疫組化分析顯示它們并沒有顯著的區(qū)別。

11、r>　　 小結(jié)：在兩種軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在兩種光聚合水凝膠里，能夠保持良好的生物活性和一定的細(xì)胞增殖性?；らg充質(zhì)干細(xì)胞在兩種光聚合水凝膠中都實(shí)現(xiàn)了向關(guān)節(jié)軟骨組織分化。盡管相比較滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PEGDA水凝膠實(shí)驗(yàn)組，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PhosPEG水凝膠實(shí)驗(yàn)組向關(guān)節(jié)軟骨組織分化能力稍弱一些，但PhosPEG水凝膠具有很好的可降解性，所以滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PhosPEG水凝膠具有更廣闊的應(yīng)用前景。

12、
　　 第三章：滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合可注射Gellan水凝膠支架材料體外工程化關(guān)節(jié)軟骨。
　　 兔滑膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合可注射的Gellan水凝膠后，分別在四組軟骨誘導(dǎo)液(無生長(zhǎng)因子，TGF-β1，TGF-β3，BMP-2)誘導(dǎo)培養(yǎng)21天和42天。我們采用Live-Dead Assay、WST-1 Assay、Real-time RT-PCR、Biochemical Assay和Histology and Imm

13、unohistochemistry五種實(shí)驗(yàn)方法分析體外組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的效果。
　　 ⑴Live-Dead Assay顯示在第21天時(shí)間點(diǎn)里，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在Gellan水凝膠體系里保持較高的細(xì)胞活性。
　　 ⑵WST-1 Assay顯示滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在所有的實(shí)驗(yàn)組都保持較高的細(xì)胞增殖性。
　　 ⑶相比較2D和3D對(duì)照組，Real time RT-PCR分析顯示所有實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨特有的幾個(gè)標(biāo)志基因的表達(dá)都

14、有不同程度的增高。相比較BMP2誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組，TGFβ1和TGFβ3兩個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)基因的表達(dá)有更明顯的增高。另外，Collagen TypeⅠ是成纖維軟骨的主要成分之一，但所有實(shí)驗(yàn)組CollagenTypeⅠ的表達(dá)都呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。
　　 ⑷Biochemical Assay分析顯示sGAG和Collagen總含量在所有實(shí)驗(yàn)組里都有不同程度的增高。相比較TGFβ1和TGFβ3誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組，BMP-2誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組的sGAG

15、和Collagen表達(dá)有所降低，這與Real-time RT-PCR分析結(jié)果基本一致。
　　 ⑸Immunohistochemistry分析顯示所有實(shí)驗(yàn)組都清晰表達(dá)Collagen TypeⅡ和Aggrecan。另外，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞在所有實(shí)驗(yàn)組都呈現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)，并且保持高密度。
　　 小結(jié)：在體外軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞可注射Gellan水凝膠復(fù)合體能夠形成高質(zhì)量的組織工程化關(guān)節(jié)軟骨。在同一劑量下，

16、相比較BMP-2生長(zhǎng)因子，TGFβ1和TGFβ3兩種生長(zhǎng)因子更能促進(jìn)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在水凝膠支架材料中向關(guān)節(jié)軟骨組織分化。另外，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在Gellan水凝膠支架材料中，能夠保持很好的細(xì)胞增殖性和細(xì)胞相容性。因此，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合可注射Gellan水凝膠支架材料是一個(gè)有前途的策略應(yīng)用在未來工程化關(guān)節(jié)軟骨組織的構(gòu)建。
　　 結(jié)論：①滑膜組織相連接于關(guān)節(jié)軟骨組織。在關(guān)節(jié)軟骨組織工程中，滑膜組織是一個(gè)很好的種子細(xì)胞來

17、源。②滑膜組織來源的干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物特性：成纖維細(xì)胞形態(tài)，自我增殖能力，多向分化潛能。③光聚合水凝膠支架材料可以作為滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維細(xì)胞載體。相比較不可降解的PEGDA水凝膠支架材料，可降解PhosPEG水凝膠支架材料復(fù)合滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有更加廣闊的應(yīng)用前景。⒁滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合可注射Gellan水凝膠體外能夠構(gòu)建高質(zhì)量的關(guān)節(jié)軟骨組織。⑤在同一劑量下，相比較BMP-2生長(zhǎng)因子，TGFβ1和TGFβ3兩種生長(zhǎng)因子更能促