人脂肪間充質干細胞與PHBV構建組織工程化軟骨的研究.pdf

1、目的：探討人脂肪間充質干細胞的分離、培養(yǎng)方法，研究其生物學特征及誘導分化成軟骨細胞的能力。 方法：取吸脂術后廢棄脂肪，酶消化法獲取細胞，于含10％新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中進行原代及傳代培養(yǎng)。流式細胞術檢測第6代細胞表面抗原CD29和CD44的表達情況。對第6代細胞進行成軟骨細胞誘導，誘導培養(yǎng)基為高糖DMEM，含1％新生牛血清、10μg/L TGFβ1、6.25mg/L轉鐵蛋白、1×10-7mol/L地塞米松和50mg/L

2、維生素C。觀察脂肪間充質干細胞的生長情況、形態(tài)變化。于誘導14天時應用阿爾新蘭染色、甲苯胺蘭染色、番紅0染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色、Aggrecan免疫熒光染色了解其分化成軟骨細胞的能力。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測脂肪間充質干細胞誘導0天、14天時Ⅱ型前膠原的基因表達情況。蛋白印跡試驗(Western-blot)檢測脂肪間充質干細胞誘導0天、14天時Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan蛋白的表達情況。 結果：原代培養(yǎng)

3、后24小時少量圓形及多角形細胞開始貼壁生長，48-72小時貼壁細胞數(shù)量增多并以短梭形和多角形為主，5天時細胞形態(tài)呈長梭形，10-12天細胞融合達90-100％。傳代細胞貼壁時間較原代細胞縮短，6小時80％細胞完成貼壁，6天左右細胞單層融合。傳3代后細胞形態(tài)均呈長梭形。10代以后細胞出現(xiàn)橢圓形、短梭形樣變，停止生長并逐漸脫壁。流式細胞術檢測第6代細胞有91％表達CD44，98％表達CD29。在誘導培養(yǎng)基作用下，脂肪間充質干細胞生長增殖減慢

4、，形態(tài)由長梭型漸變?yōu)槿切巍⒍嘟切危?4天時部分細胞聚集成軟骨細胞特有的鋪路石樣改變。誘導培養(yǎng)基作用下14天時阿爾新蘭、甲苯胺蘭、番紅0、Ⅱ型膠原蛋白免疫組化、Aggrecan免疫熒光等染色均呈陽性。RT-PCR檢測0天時前Ⅱ型膠原基因呈陰性表達，14天時呈陽性表達。Western-blot檢測在脂肪間充質干細胞誘導后0天時Ⅱ型膠原、Aggrecan的蛋白為陰性表達，14天時為陽性表達。 結論：可從吸脂術來源的脂肪組織中分離培養(yǎng)