人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與PHBV構(gòu)建組織工程化軟骨的研究.pdf

1、目的：探討人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，研究其生物學(xué)特征及誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞的能力。 方法：取吸脂術(shù)后廢棄脂肪，酶消化法獲取細(xì)胞，于含10％新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第6代細(xì)胞表面抗原CD29和CD44的表達(dá)情況。對(duì)第6代細(xì)胞進(jìn)行成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為高糖DMEM，含1％新生牛血清、10μg/L TGFβ1、6.25mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、1×10-7mol/L地塞米松和50mg/L

2、維生素C。觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)情況、形態(tài)變化。于誘導(dǎo)14天時(shí)應(yīng)用阿爾新蘭染色、甲苯胺蘭染色、番紅0染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色、Aggrecan免疫熒光染色了解其分化成軟骨細(xì)胞的能力。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)0天、14天時(shí)Ⅱ型前膠原的基因表達(dá)情況。蛋白印跡試驗(yàn)(Western-blot)檢測(cè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)0天、14天時(shí)Ⅱ型膠原蛋白和Aggrecan蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：原代培養(yǎng)

3、后24小時(shí)少量圓形及多角形細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，48-72小時(shí)貼壁細(xì)胞數(shù)量增多并以短梭形和多角形為主，5天時(shí)細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，10-12天細(xì)胞融合達(dá)90-100％。傳代細(xì)胞貼壁時(shí)間較原代細(xì)胞縮短，6小時(shí)80％細(xì)胞完成貼壁，6天左右細(xì)胞單層融合。傳3代后細(xì)胞形態(tài)均呈長(zhǎng)梭形。10代以后細(xì)胞出現(xiàn)橢圓形、短梭形樣變，停止生長(zhǎng)并逐漸脫壁。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第6代細(xì)胞有91％表達(dá)CD44，98％表達(dá)CD29。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖減慢

4、，形態(tài)由長(zhǎng)梭型漸變?yōu)槿切?、多角形?4天時(shí)部分細(xì)胞聚集成軟骨細(xì)胞特有的鋪路石樣改變。誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下14天時(shí)阿爾新蘭、甲苯胺蘭、番紅0、Ⅱ型膠原蛋白免疫組化、Aggrecan免疫熒光等染色均呈陽(yáng)性。RT-PCR檢測(cè)0天時(shí)前Ⅱ型膠原基因呈陰性表達(dá)，14天時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)。Western-blot檢測(cè)在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后0天時(shí)Ⅱ型膠原、Aggrecan的蛋白為陰性表達(dá)，14天時(shí)為陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論：可從吸脂術(shù)來(lái)源的脂肪組織中分離培養(yǎng)