人臍帶間充質(zhì)干細胞復合殼聚糖-P(LLA-CL)支架體外構建組織工程軟骨.pdf

1、由于創(chuàng)傷、腫瘤及退行性變等各種原因?qū)е碌年P節(jié)軟骨損傷在臨床上常見,然而由于軟骨細胞屬于終末分化細胞,軟骨本身缺乏血管營養(yǎng)等原因?qū)е萝浌墙M織很難自身修復,從而容易導致關節(jié)功能障礙乃至骨關節(jié)炎的發(fā)生;目前臨床上修復關節(jié)軟骨損傷常用的方法如關節(jié)腔清理術、關節(jié)磨削成形術、軟骨下骨鉆孔術及微骨折術等均存在一定不足,而自體或異體軟骨細胞移植也存在來源受限及不同程度免疫排斥等問題;比較而言,軟骨組織工程無疑是最有發(fā)展前景的前沿技術。本課題通過研究人臍

2、帶沃頓膠組織來源間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及擴增探討新型組織工程種子細胞來源;并對骨髓及臍帶來源干細胞的成軟骨定向誘導分化能力進行比較研究,從而優(yōu)化選擇軟骨組織工程種子細胞。制備新型殼聚糖/P(LLA-CL)軟骨組織工程多孔支架,根據(jù)組織工程的基本原理體外構建組織工程軟骨,以期為軟骨組織工程的深入研究和發(fā)展提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎。
　　第一章人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性研究
　　目的：研究人臍帶沃頓膠來源間充

3、質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)并對其進行鑒定,對其生物學特性進行初步研究,為組織工程種子細胞研究提供實驗基礎。
　　方法：無菌獲取胎兒臍帶沃頓膠組織,采用混合酶消化法獲取細胞。加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng);待細胞生長至80～90％融合時,1:3傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)變化,流式細胞儀檢測傳3代臍帶干細胞細胞周期及表面抗原標志,采用MTT法測定第3、5、7代臍帶間充質(zhì)干細胞增殖能力,通過定向誘導檢測臍

4、帶干細胞多向分化潛能。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)后12小時即可見少量細胞貼壁,24～48小時后大量細胞貼壁,細胞呈短梭形、梭形及多角形;細胞培養(yǎng)4～5天即進入生長對數(shù)期,開始以集落方式生長,細胞呈均一的成纖維樣細胞形態(tài);8～10天單層細胞融合接近80％,呈漩渦樣生長。傳代后細胞貼壁和增殖速度均明顯加快,2小時左右即可見細胞貼壁,多數(shù)為成纖維細胞,細胞呈平行排列生長或旋渦狀生長。流式細胞術分析顯示,第3代臍帶間充質(zhì)干細胞超過80％的細胞處

5、于G0/G1期(81.13％),表明細胞具有較強的增殖潛能。流式細胞儀檢測傳3代臍帶干細胞表達CD13、CD29、CD44、CD105,不表達造血細胞表型CD45、HLA-DR和內(nèi)皮細胞特征性表型CD31;MTT法檢測結(jié)果表明第3、5、7代臍帶干細胞均有較強的體外增殖能力;經(jīng)體外定向誘導臍帶間充質(zhì)干細胞可成功向成骨細胞及脂肪細胞分化。
　　結(jié)論：采用混合酶消化法可成功分離培養(yǎng)人臍帶沃頓膠來源干細胞,經(jīng)檢測符合間充質(zhì)干細胞基本生物學

6、特性,是軟骨組織工程良好的種子細胞來源。
　　第二章人臍帶與骨髓來源間充質(zhì)干細胞成軟骨特性比較
　　目的：臍帶和骨髓來源間充質(zhì)干細胞均具有多向分化潛能,觀察人臍帶沃頓膠來源間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為軟骨細胞特性及相關基因表達,比較其與骨髓來源間充質(zhì)干細胞成軟骨分化能力的差異,從而優(yōu)化選擇軟骨組織工程種子細胞。
　　方法：采用混合酶消化法從足月胎兒臍帶沃頓膠組織分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞,取第3代臍帶干細胞和平行培養(yǎng)的第3代骨

7、髓間充質(zhì)干細胞,均以2×105/cm2的密度接種后用條件培養(yǎng)基誘導其成軟骨分化;臍帶及骨髓對照組均采用普通培養(yǎng)基,不添加任何誘導因子。倒置顯微鏡下觀察細胞生長和形態(tài)變化;誘導14天后通過甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色比較觀察細胞內(nèi)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原著色情況;采用RT-PCR技術檢測細胞成軟骨誘導過程中Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA基因表達差異。
　　結(jié)果：臍帶間充質(zhì)干細胞在成軟骨誘導后細胞形態(tài)由長梭形逐漸

8、變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?細胞逐漸聚集;誘導14天后臍帶及骨髓MSC誘導組甲苯胺藍染色均呈陽性,前者胞漿胞膜異染明顯呈強陽性反應;臍帶MSC對照組染色為淡藍色呈弱陽性,異染細胞數(shù)量較少,而骨髓MSC對照組細胞無異染呈陰性;Ⅱ型膠原免疫組化染色臍帶及骨髓MSC誘導組細胞基質(zhì)均有棕黃色著色,前者異染明顯呈強陽性反應;臍帶MSC對照組細胞胞漿內(nèi)散在淡棕色,而骨髓MSC對照組染色無異染呈陰性;R17-PCR檢測結(jié)果顯示臍帶MSC不加誘導情況下弱表達S

9、ox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA,誘導后基因表達加強(P＜0.05);骨髓MSC對照組無表達,誘導后呈陽性反應;臍帶MSC誘導組基因表達顯著強于骨髓MSC誘導組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：臍帶和骨髓來源間充質(zhì)干細胞體外經(jīng)定向誘導均可向軟骨細胞分化,前者成軟骨能力更強;臍帶干細胞在不加誘導情況下有自發(fā)成軟骨分化傾向;與骨髓間充質(zhì)干細胞相比臍帶干細胞可能更適合于軟骨組織工程。
　　第三章殼聚糖/P(LLA-C

10、L)多孔泡沫支架的制備及生物相容性研究
　　目的：制備新型生物材料殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架并對其理化性質(zhì)及生物相容性進行檢測,探討其作為軟骨組織工程支架材料的可能性。
　　方法：制備殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架,對支架行掃描電鏡觀察,測定支架孔徑、孔隙率及吸水率;分離培養(yǎng)第3代臍帶問充質(zhì)干細胞,將其與殼聚糖/P(LLA-CL)支架復合后誘導培養(yǎng)為實驗組,單純P(LLA-CL)聚合物支架為對照組。倒置顯

11、微鏡觀察細胞在支架上粘附及生長增殖情況,HE染色顯示細胞在支架內(nèi)部分布狀況;于接種后4、8、12、24h取樣采用細胞計數(shù)法測定細胞黏附率;分別于1、3、5、7d取樣采用MTT法分析復合支架對細胞增殖的影響;復合培養(yǎng)1周及2周時取材行掃描電鏡觀察細胞在材料表面的生長增殖以及基質(zhì)分泌情況;行裸鼠皮下包埋實驗檢測支架組織相容性。
　　結(jié)果：制備的殼聚糖/P(LLA-CL)支架為多孔泡沫狀圓柱體結(jié)構,支架表面孔隙較多;掃描電鏡顯示支架孔隙

12、分布均勻,材料內(nèi)空隙相互連通;支架孔徑為(183.56±16.78)um;孔隙率為(91.56±1.27)％;吸水率為(218.66％±1.55)％。支架材料接種細胞懸液后,細胞在支架表面及空隙內(nèi)均勻擴散,}玎巳染色顯示殼聚糖/P(LLA-CL)支架內(nèi)細胞大量存在,沿孔道均勻分布,對照組支架內(nèi)細胞數(shù)量較少;MTT法顯示兩種支架均對細胞生長無抑制作用,實驗組殼聚糖復合支架對細胞增殖有一定促進作用;細胞計數(shù)結(jié)果顯示隨時間延長兩組材料上細胞黏

13、附率逐漸增高,各時間點實驗組支架細胞黏附率均顯著高于對照組(P＜0.05);細胞.支架復合培養(yǎng)1周及2周時掃描電鏡觀察細胞在殼聚糖/P(LLA-CL)支架上均勻分布,細胞密集生長,基質(zhì)分泌旺盛;對照組細胞分泌基質(zhì)較少。裸鼠皮下包埋實驗結(jié)果顯示P(LLA-CL)復合殼聚糖后有效降低了支架炎性反應程度,組織相容性良好。
　　結(jié)論：殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架具備合適的孔徑及孔隙率,生物相容性良好,可作為軟骨組織工程良好的細胞

14、載體。
　　第四章臍帶干細胞復合殼聚糖/P(LLA-CL)支架體外構建組織工程軟骨
　　目的：探討臍帶干細胞復合殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架體外初步構建組織工程軟骨的可能性。
　　方法：分離培養(yǎng)第3代臍帶間充質(zhì)干細胞,將臍帶干細胞與預處理的殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架復合培養(yǎng);實驗分為誘導組及對照組,細胞根據(jù)分組不同分別加入成軟骨誘導培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。復合培養(yǎng)3周后取出細胞支架復合物,將復

15、合物切片進行臟染色、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色;RT-PCR檢測各組復合物培養(yǎng)7,14,21天表達Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA的情況;Western-blot檢測Ⅱ型膠原蛋白及aggrecan蛋白表達;
　　結(jié)果：細胞-材料復合誘導后隨著時間延長復合物表面逐漸光滑有色澤,質(zhì)地較柔韌,有類軟骨樣組織形成,而對照組復合物體積略皺縮,光澤較差;體外誘導培養(yǎng)3周實驗組HE染色可見陷窩樣結(jié)構,有軟骨樣基質(zhì)形成

16、;對照組則未見陷窩樣結(jié)構,細胞分泌基質(zhì)較少;甲苯胺藍染色可見誘導組細胞及細胞外基質(zhì)藍色異染明顯呈強陽性反應,對照組染色為淡藍色,異染不明顯呈弱陽性反應;Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示誘導組大量細胞內(nèi)外均有棕黃色著色呈強陽性反應,而對照組無明顯棕黃色;RT-PCR檢測結(jié)果顯示實驗組隨著誘導時間延長Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA表達逐漸增強,而對照組各基因表達水平無明顯變化,各時間點誘導組和對照組mRNA表達水平兩兩比較均有