間充質(zhì)干細胞聯(lián)合復合支架構(gòu)建組織工程瓣膜的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：組織工程瓣膜種子細胞的研究
　　 目的：采用間充質(zhì)干細胞（MSCs）構(gòu)建組織工程心臟瓣膜（TEHV），并對MSCs的細胞生物學，及所構(gòu)建TEHV的生物學和生物力學性能進行研究。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs和肌成纖維細胞，進行細胞鑒定后分別種植于去細胞豬主動脈瓣葉支架上，然后在體外培養(yǎng)14 d 構(gòu)建TEHV，并分別做為實驗組A和B。對MSCs的細胞生物學，及兩組TEHV的生

2、物學和生物力學性能進行檢測。
　　 結(jié)果：MSCs表達CD29 (94.82%)和CD44 (93.59%)。免疫組化和熒光染色檢測顯示MSCs的Vimentin 染色均為陽性，部分MSCs的α-SMA 染色陽性。實驗組B的α-SMA、MMP-13和TIMP-1 mRNA表達均高于實驗組A（P<0.05），而LOX蛋白含量和LOX mRNA表達均低于實驗組A（P<0.05）。兩組TEHV的形態(tài)學結(jié)構(gòu)相似。實驗組A 支架上MSCs

3、的Vimentin 染色均為陽性，部分MSCs的α-SMA 染色陽性。兩組TEHV的DNA和羥脯氨酸含量，最大負荷、最大應力、最大應變和彈性模量的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：在采用MSCs 體外構(gòu)建TEHV 過程中，其細胞生物學性能與肌成纖維細胞相比存在差異，而兩者所構(gòu)建TEHV的生物學和生物力學性能相當。這說明MSCs 構(gòu)建的TEHV 并沒有在性能方面體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。有必要通過其他方法，對MSCs 構(gòu)建的

4、TEHV 性能加以改善。
　　 第二部分：bFGF 調(diào)控組織工程瓣膜構(gòu)建的研究
　　 目的：探討堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對MSCs 構(gòu)建的TEHV的生物學和生物力學性能的影響。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs，種植于去細胞瓣葉支架上。將支架置于含10 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)14 d 構(gòu)建的TEHV做為實驗組A。實驗組B 除培養(yǎng)液中不添加bFGF外，其余同實驗組A。實驗組C 為大鼠肌成纖維

5、細胞構(gòu)建的TEHV。對MSCs的細胞生物學，及各組TEHV的生物學和生物力學性能進行檢測。
　　 結(jié)果：實驗組A和C的α-SMA、MMP-13和TIMP-1 mRNA表達的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但均高于實驗組B（P<0.05）。實驗組A和C的LOX 蛋白含量和LOX mRNA表達的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但均低于實驗組B（P<0.05）。實驗組A 支架的再細胞化程度明顯優(yōu)于實驗組B和C；DNA和羥脯氨酸含量

6、高于實驗組B和C（P<0.05）。各組TEHV 生物力學性能的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：在采用MSCs 聯(lián)合bFGF 體外構(gòu)建TEHV 過程中，通過bFGF的調(diào)控作用，可以使MSCs的表型特性、基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的表達增強，達到與肌成纖維細胞相當?shù)乃?；可以使MSCs的LOX 蛋白和基因表達降低，達到與肌成纖維細胞相當?shù)乃?；可以提高TEHV的生物學性能。但bFGF 改善TEHV 生物力學性能的作用不

7、明顯。
　　 第三部分：組織工程瓣膜復合支架的研究
　　 目的：采用靜電紡絲技術制備復合支架，然后在支架上種植MSCs 構(gòu)建TEHV，并研究復合支架對TEHV的生物學和生物力學性能的影響。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs和肌成纖維細胞。實驗組A 為豬主動脈瓣葉經(jīng)去細胞處理后，在其表面涂鋪采用靜電紡絲技術制備的聚（3-羥基丁酸酯－co-4-羥基丁酸酯）（P3/4HB）纖維膜，構(gòu)建復合支架。實驗組B和C 為去細胞豬

8、主動脈瓣葉支架。在實驗組A和B的支架上種植MSCs，在實驗組C的支架上種植肌成纖維細胞，各組均在體外培養(yǎng)14 d 構(gòu)建TEHV，并進行生物學和生物力學檢測。
　　 結(jié)果：復合支架的整個P3/4HB 纖維膜結(jié)構(gòu)均一，平均直徑是156±3 nm，并且與去細胞瓣葉支架表面緊密結(jié)合。各組支架的再細胞化程度相當，DNA和羥脯氨酸含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗組A與實驗組B、C 相比，最大負荷、最大應力和彈性膜量明顯上升（P<0

9、.05），而最大應變的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：復合支架能明顯增強TEHV的生物力學性能，而其對TEHV 生物學性能的改善作用不明顯。
　　 第四部分：間充質(zhì)干細胞聯(lián)合bFGF 復合支架構(gòu)建組織工程瓣膜的研究
　　 目的：采用MSCs 聯(lián)合bFGF 復合支架構(gòu)建TEHV，以改善TEHV的生物學和生物力學性能。
　　 方法：分離培養(yǎng)大鼠MSCs。實驗組A 為豬主動脈瓣葉經(jīng)去細胞處理后，

10、在其表面涂鋪采用緩釋和靜電紡絲技術制備的含有bFGF 殼聚糖納米粒的P3/4HB 纖維膜，構(gòu)建復合支架（bFGF）。實驗組B 為在去細胞瓣葉表面涂鋪P3/4HB 纖維膜，構(gòu)建復合支架。實驗組C和D 為去細胞瓣葉支架。然后在各組支架上種植MSCs，實驗組C 在含10 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其余各組均在不含bFGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。各組均在體外培養(yǎng)14 d 構(gòu)建TEHV。各組TEHV 進行生物學和生物力學檢測。
　　 結(jié)

11、果：復合支架（bFGF）的載藥量為0.00077%，包封率為88.1%，累積釋放度為1d 約16.3%，5 d 約42.4%，10 d 約51.1%和15 d 約53.9%。復合支架（bFGF）的整個bFGF 殼聚糖納米粒P3/4HB 纖維膜結(jié)構(gòu)均一，并且與去細胞瓣葉支架表面緊密結(jié)合。實驗組A和C 支架的再細胞化程度明顯優(yōu)于實驗組B和D，DNA和羥脯氨酸含量明顯高于實驗組B和D（P<0.05）。實驗組A和B與實驗組C和D 相比，最大負荷