脂肪來源間充質干細胞復合PGA-PLA支架構建微血管化工程組織的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、組織移植是整形外科修復組織缺損的常用治療手段。近年來,飛速發(fā)展的組織工程技術給組織修復帶來了新的希望。組織工程化組織移植與自體組織移植類似,植入體內后同樣存在一個血運重建的過程。然而,組織工程移植物血管化的速度通常非常緩慢,血管化不良已經成為組織工程發(fā)展的限制因素。研究表明,三維支架的使用有利于細胞形成管樣結構和構建復合組織。人脂肪來源的間充質干細胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)可以沿

2、著心血管方向分化且具有促血管形成特性。聚羥基乙酸(Polyglycolic acid,PGA)因其優(yōu)越的性能在骨、軟骨、肌腱等組織工程領域應用已久。hADSCs接種在聚乳酸(Polylactic acid,PLA)塑形后的PGA三維支架上是否有利于構建微血管化的工程組織尚未見報道。我們的研究可能為提高工程組織血管化效率,促進皮膚缺損和慢性創(chuàng)面的愈合帶來新的契機。
  目的:
  1.評價hADSCs接種在PGA/PLA復合支

3、架后定向分化為血管內皮細胞的潛能,探索將hADSCs-PGA/PLA復合物構建為微血管化的組織工程產物的可行性。
  2.探索hADSCs-PGA/PLA復合物的生物相容性。
  3.觀察誘導后的hADSCs-PGA/PLA復合物對裸鼠皮膚缺損愈合情況的影響,為提高血管化效率以促進創(chuàng)面愈合提供實驗依據。
  方法和結果:
  1.人脂肪間充質干細胞復合PGA/PLA支架后分化為內皮細胞能力的研究
  方法:

4、取新鮮游離脂肪顆粒,采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法對hADSCs進行分離和純化。將hADSCs接種于PGA/PLA支架材料后,使用額外添加20ng/mL血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的成血管內皮細胞誘導培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng),通過掃描電鏡觀察hADSCs在PGA/PLA支架材料上的貼附、生長與增殖情況。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞活性以及攝取乙?;兔芏戎鞍缀徒Y合荊豆凝集素

5、的能力,并于培養(yǎng)第7、14、21d進行免疫熒光染色觀察細胞對CD31、vWF、VEGFR2、α-SMA的表達,同時提取細胞總RNA進行Real-time PCR檢測VEGF、vWF、eNOS、α-SMA基因表達,綜合評價hADSCs在PGA/PLA支架材料上定向誘導為血管內皮細胞的潛能。
  結果:hADSCs可以在PGA/PLA支架上良好地貼附、生長和增殖,并在誘導培養(yǎng)21d時獲得血管內皮細胞特征性抗原標記,同時具有攝取乙?;?/p>

6、密度脂蛋白和結合荊豆凝集素的能力,并且CD31、VEGFR2、vWF、eNOS基因表達在14d和21d均高于未誘導或者二維誘導的hADSCs(p<0.05),而α-SMA的表達在細胞水平和mRNA水平均較低(p<0.05)。
  2.誘導后的人脂肪間充質干細胞-PGA/PLA復合物的體外免疫抑制作用
  方法:分離人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),將成內皮細

7、胞誘導培養(yǎng)的hADSCs-PGA/PLA(hADSCs-PGA/PLA誘導組)與PBMC體外共培養(yǎng),3d后CFSE法觀察PBMC的增殖情況,ELISA法檢測炎性細胞因子IFN-γ和IL-2的分泌水平,采用Transwell小室同時檢測hADSCs-PGA/PLA誘導組與PBMC直接接觸和間接接觸時免疫抑制情況的差異。
  結果:PHA能刺激PBMC的增殖和對炎性因子的分泌。hADSCs-PGA/PLA誘導組與PBMC共培養(yǎng)不能刺激

8、PBMC增殖,也不能使IFN-γ和IL-2分泌增加。相反,hADSCs-PGA/PLA誘導組能夠顯著抑制與PHA共培養(yǎng)的PBMC的增殖以及對IFN-γ和IL-2的分泌(p<0.05)。且細胞-細胞直接接觸組抑制PBMC分泌IFN-γ和IL-2的能力大于間接接觸組(p<0.05)。
  3.誘導后的人脂肪間充質干細胞-PGA/PLA復合物修復皮膚缺損能力的研究
  方法:以BALB/c裸鼠為實驗動物構建皮膚缺損模型,以覆蓋成內

9、皮細胞誘導培養(yǎng)的hADSCs-PGA/PLA和組織工程皮膚為治療手段,選取7d、14d、21d三個時間點觀察皮膚缺損愈合情況,同時進行透光實驗、HE染色等判斷血管新生情況,采用天狼星紅染色、Masson染色觀察新生皮膚組織膠原纖維的類型以及沉積和排列。為進一步探索誘導后hADSCs在新生血管形成中的作用和角色,我們采用綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)慢病毒轉染的hADSCs接種部分PGA/PLA

10、支架,植入體內21d取材切片CD31免疫熒光染色后進行示蹤。
  結果:誘導后的hADSCs-PGA/PLA能顯著加快皮膚創(chuàng)面修復速度,新生組織具有更豐富的血管,且膠原纖維的沉積和排列與正常皮膚組織無明顯差異。同時,免疫熒光染色顯示,支架上的hADSCs直接參與新生血管的組成。
  結論:
  1.PGA/PLA復合支架是一種生物相容性良好的可降解材料,hADSCs在PGA/PLA支架上可以良好的貼附、生長和增殖,在成

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