同種異基因脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞輔助自體脂肪移植的實驗研究.pdf

1、脂肪移植技術(shù)因脂肪組織來源豐富，獲取方便，操作相對簡單、微創(chuàng)，故在美容和修復(fù)重建領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。然而，術(shù)后移植的脂肪容易出現(xiàn)脂肪結(jié)節(jié)、囊泡等并發(fā)癥，更因術(shù)后低且不穩(wěn)定的脂肪容積保有率(20-80％)嚴(yán)重制約了該技術(shù)進一步發(fā)展。2001年Zuk等學(xué)者第一次從人的脂肪組織中分離出具有多向分化能力的干細(xì)胞，命名為脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)。ADSCs具有轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力，具有抗組織細(xì)胞凋亡和促進移植物血管

2、化的作用，因此利用ADSCs輔助自體脂肪移植能明顯降低脂肪結(jié)節(jié)、囊泡等并發(fā)癥的發(fā)生幾率，降低脂肪吸收率，進而提高移植脂肪成活質(zhì)量和長期容積保有率。然而，消瘦的患者缺乏可以獲得充足ADSCs的脂肪組織;ADSCs的分化與再生能力隨年齡的增加而減弱，故難以從老年患者體內(nèi)獲得高活力的ADSCs;糖尿病、紅斑狼瘡等自身免疫相關(guān)性疾病改變了該類患者ADSCs的細(xì)胞屬性，使其自身的ADSCs喪失了細(xì)胞保護和再生的功能?；谝陨显?，傳統(tǒng)的ADSCs

3、輔助脂肪移植術(shù)在消瘦的、老齡的、自身免疫相關(guān)性疾病的患者中無法有效展開。鑒于ADSCs具有低免疫性和免疫抑制能力，利用同種異基因充足、健康的ADSCs輔助自體脂肪移植可能是解決上述問題有效的方法。
　　研究目的：
　　1、通過對Lewis和BN大鼠腹股溝皮下脂肪和附睪周圍脂肪組織的ADSCs獲取、培養(yǎng)、鑒定，探討哪個部位來源的ADSCs具有更高的生物活性。
　　2、通過建立刀豆蛋白刺激脾單個核細(xì)胞(MNCs)增殖的模型

4、，探究不同濃度的ADSCs對于MNCs增殖的影響;探討同基因和異基因ADSCs的低免疫原性和免疫抑制能力。
　　3、建立BN大鼠來源的ADSCs輔助Lewis大鼠脂肪移植的動物模型，觀察同種異基因ADSCs是否降低了自體脂肪移植過程中的細(xì)胞損傷程度;是否促進移植脂肪的再血管化過程;是否提高了移植脂肪的長期容積保有率。并檢測了移植的同種異基因ADSCs和宿主間可能發(fā)生的免疫反應(yīng)。
　　研究方法：
　　1、Lewis和BN

5、大鼠的腹股溝皮下脂肪和附睪周圍脂肪通過酶消化法來分離和培養(yǎng)ADSCs，通過表面分子檢測和誘導(dǎo)分化鑒定其是否為ADSCs;并且測定兩種部位來源細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生長曲線、細(xì)胞周期。
　　2、利用流式細(xì)胞分析儀檢測與免疫原性相關(guān)的細(xì)胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ;建立ADSCs與活化的MNCs共培養(yǎng)的細(xì)胞模型，檢測在此共培養(yǎng)體系中同基因和異基因ADSCs對脾單個核細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、以及CD4/C

6、D25/Foxp3 Treg細(xì)胞比例的影響。
　　3、建立BN大鼠來源的ADSCs輔助Lewis大鼠自體脂肪移植的動物模型。在脂肪移植術(shù)后7天和14天，檢測了HE組織染色、脂周蛋白、原位細(xì)胞凋亡等反映脂肪組織細(xì)胞損傷指標(biāo);進行了VEGF的ELAISA和CD34的免疫組織化學(xué)等反映移植組織血管化指標(biāo)的檢測;進行了外周血CD4/CD8和CD4/CD25/Foxp3等反映免疫反應(yīng)指標(biāo)的檢測。
　　研究結(jié)果：
　　1、Lewi

7、s和BN大鼠獲取的ADSCs，無種屬上的明顯區(qū)別;但與腹股溝皮下脂肪相比，兩種大鼠附睪周圍脂肪組織的纖維組織更少，在進行剪碎脂肪操作時更加省時省力;附睪脂肪組織純度更高，單位質(zhì)量獲取的ADSCs的數(shù)量更多;而且附睪來源的ADSCs具有更早的貼壁時間，更佳的增殖能力和更短的傳代時間;綜上所述，附睪脂肪組織來源的ADSCs更加適合作為實驗細(xì)胞。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，ADSCs不表達(dá)CD40、CD80、CD84、MHC-Ⅱ和中度

8、表達(dá)MHC-Ⅰ。在ADSCs與活化的MNCs共培養(yǎng)的細(xì)胞模型中，ADSCs明顯降低了MNCs的增殖，增加了處于G0/G1期的MNCs細(xì)胞比例;抑制了MNCs的凋亡;提高了具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)能力的CD4/CD25/Foxp3 Treg細(xì)胞的比例。
　　3、在建立BN大鼠來源的ADSCs輔助Lewis大鼠脂肪移植的模型中，發(fā)現(xiàn)異基因和同基因ADSCs均能減輕移植術(shù)后7天、14天的脂肪細(xì)胞損傷與凋亡;增加移植物血管密度和血管內(nèi)皮生長因子的

9、含量;提高術(shù)后3月時脂肪容積保有率。移植術(shù)后7天、14天的宿主外周血中CD4/CD8比值和CD4/CD25/Foxp3 Treg含量在異基因干細(xì)胞組和對照組之間并無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)論：
　　1、與腹股溝皮下脂肪相比，Lewis和BN大鼠附睪周圍脂肪來源的ADSCs獲取效率更高和增殖傳代能力更強。
　　2、ADSCs具有低免疫原性和免疫抑制性。同基因和異基因ADSCs均能降低Lewis大鼠的已經(jīng)活化的MNCs增殖