靜脈移植脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠創(chuàng)傷性腦損傷.pdf

1、一、背景
　　 近年來原林教授等提出筋膜學(xué)假說認(rèn)為:人體由非特異性結(jié)締組織筋膜支架所構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)和被筋膜支架所包繞的功能系統(tǒng)所共同構(gòu)成。支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細(xì)胞為核心,為功能系統(tǒng)的更新提供細(xì)胞補(bǔ)充,并為功能系統(tǒng)的各種細(xì)胞的更新、代謝提供一個穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。脂肪組織是支持與儲備系統(tǒng)的重要組成部分,其中的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedmesenchymal stem cells,ADMSCs)是機(jī)

2、體重要的干細(xì)胞儲備之一。對機(jī)體不同部位(如內(nèi)臟和皮下脂肪組織)中的ADMSCs深入研究,分析其免疫表型的差異以及多向分化能力有無差別,能對筋膜學(xué)假說提供部分理論支持,同時也是進(jìn)行干細(xì)胞移植取材時應(yīng)該考慮的問題。
　　 ADMSCs也是目前干細(xì)胞的研究熱點之一。間充質(zhì)干細(xì)胞具備成體干細(xì)胞的特征,能無限傳代和多向分化。目前已經(jīng)從多種組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,包括骨髓、脂肪、臍帶血、外周血和骨骼肌等。間充質(zhì)干細(xì)胞中研究較為深入的是骨髓

3、間充質(zhì)干細(xì)胞,能在一定的條件下分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是首先分離的間充質(zhì)干細(xì)胞,已經(jīng)作為種子細(xì)胞在各種移植實驗中取得了明顯的效果。近期的研究發(fā)現(xiàn),同樣具有多向分化能力的ADMSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有取材手術(shù)小、可重復(fù)進(jìn)行、酶消化分離程序簡單等優(yōu)點,可作為新的成體干細(xì)胞來源,引起了許多研究者的興趣。
　　 自體ADMSCs作為種子細(xì)胞是理想的,為獲取大量的自體ADMSCs作

4、為種子細(xì)胞,需要獲得脂肪組織后在體外進(jìn)行分離擴(kuò)增。機(jī)體作為獲取自體ADMSCs的脂肪組織供體,一般處于某種病理狀態(tài)下(如創(chuàng)傷狀態(tài)下)。在這種病理狀態(tài)下能否獲得足夠數(shù)量和質(zhì)量的自體ADMSCs,機(jī)體的病理狀態(tài)是否對ADMSCs的多向分化和表面標(biāo)志造成了影響,是進(jìn)行ADMSCs移植治療研究中應(yīng)該考慮的問題之一。
　　 創(chuàng)傷性腦損傷的治療是目前世界范圍內(nèi)的一個難題。腦損傷后病理過程復(fù)雜,而且神經(jīng)系統(tǒng)本身的再生能力差,在治療方面面臨許多

5、難題。但目前的各種治療方法都不能達(dá)到理想的效果,近年來干細(xì)胞移植治療給創(chuàng)傷性腦損傷的治療帶來了希望,許多學(xué)者進(jìn)行了大量的實驗研究。細(xì)胞移植治療腦損傷的機(jī)理可能是促進(jìn)了神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,或者是替代了損傷的神經(jīng)細(xì)胞。我們研究的內(nèi)容是靜脈移植ADMSCs能否促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的恢復(fù)以及對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞源性營養(yǎng)因子的影響。
　　 二、目的
　　 1、分離培養(yǎng)SD大鼠的ADMSCs,并進(jìn)行表面標(biāo)志CD11b、CD

6、29、CD45、CD49d、CD90和CD106的檢測,進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)檢測多向分化能力；
　　 2、內(nèi)臟(大網(wǎng)膜)和皮下取材獲得的ADMSCs在成骨成脂分化能力定量測定、增殖能力以及表面標(biāo)志是否存在差異；
　　 3、創(chuàng)傷狀態(tài)(皮膚切口)對獲取的ADMSCs的收獲率、增殖能力和表面標(biāo)志是否造成了影響；
　　 4、靜脈移植ADMSCs能否促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),能否遷移到損傷區(qū)域以及對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

7、和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量有無影響
　　 三、方法
　　 1、ADMSCs的分離培養(yǎng)、多向分化、表面標(biāo)志鑒定
　　 從6只SD大鼠腹股溝脂肪墊中分離培養(yǎng)ADMSCs。先將脂肪組織剪碎后用Ⅰ型膠原酶消化,離心將上層脂肪細(xì)胞從間質(zhì)血管碎片中去除,然后以8000-10000cells/cm2的密度種植于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為含10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM。24h后換液去掉未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞用來擴(kuò)增傳代

8、。相差顯微鏡下觀察ADMSCs的形態(tài)。
　　 取第4代ADMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化,經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周后用茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)。經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周后用油紅O染色檢測脂質(zhì)沉積。
　　 用流式細(xì)胞術(shù)鑒定第4代的ADMSCs的表面標(biāo)志物:CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的表達(dá)率。
　　 2、內(nèi)臟(大網(wǎng)膜)和皮下ADMSCs的比較
　　 6只SD大鼠取大網(wǎng)膜和腹

9、股溝脂肪墊,培養(yǎng)擴(kuò)增ADMSCs。相差顯微鏡下觀察兩個部位來源的ADMSCs的形態(tài)。分別取兩種來源的第4代ADMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化。每只大鼠來源的第4代腹股溝和大網(wǎng)膜ADSCs分別種植于6孔板,成脂定量方法:成脂誘導(dǎo)后用油紅O染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,后用異丙醇洗脫,在510nm波長測定光密度值OD。成骨定量方法:ADMSCs成骨誘導(dǎo)后用茜素紅染色用10％西吡氯銨洗脫,在560nm波長測量光密度值OD。用3個6孔板平均每孔的OD

10、值來表示每只大鼠來源的ADMSCs的成骨成脂分化能力
　　 取兩種第4代ADMSCs,計算細(xì)胞數(shù)目后種植于24孔培養(yǎng)板,每個24小時消化3個孔后計算細(xì)胞數(shù)。每孔計數(shù)2次,3孔的平均值為該時間點細(xì)胞數(shù)。繪制細(xì)胞生長曲線,根據(jù)公式TD=t×lg2/(lgNt-lgNo)計算出各組ADMSCs倍增時間(TD)。其中t為細(xì)胞對數(shù)生長時間,Nt為對數(shù)生長期終止時間的細(xì)胞數(shù),No為細(xì)胞生長曲線的對數(shù)生長期起始時間點細(xì)胞數(shù),計算細(xì)胞倍增時間。

11、流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種來源的第4代ADMSCs表面標(biāo)志CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的表達(dá)率。
　　 3、皮膚損傷對ADMSCs的影響
　　 6只SD大鼠在左側(cè)腹股溝做皮膚切口后縫合,7d后和6只健康鼠同取右側(cè)腹股溝脂肪墊分離培養(yǎng)ADMSCs。計算對照組和皮膚切口組每mg脂肪組織收獲到的間質(zhì)血管碎片細(xì)胞數(shù)和貼壁細(xì)胞。
　　 用這兩種第4代ADMSCs進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化,繪制生長曲線

12、并測定倍增時間。流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)志CD11b、CD29、CD45、CD49d、CD90和CD106的表達(dá)率。
　　 4、靜脈移植ADMSCs對創(chuàng)傷性腦損傷的影響
　　 創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立 采用大鼠腦冷凍傷模型作為創(chuàng)傷性腦損傷模型。36只體重200-220克SD大鼠隨機(jī)分成3組,實驗組、對照組、正常組各12只。實驗組和對照組動物水合氯醛腹腔注射麻醉成功后,手術(shù)顯微鏡于中線切開頭皮,剝離骨膜,在左側(cè)顳頂葉皮層上用牙科

13、磨鉆磨出一直徑為5mm的骨窗,保持硬腦膜完整。將-80℃預(yù)冷直徑4mm重10g的銅棒與硬腦膜充分接觸1分鐘后縫合頭皮。正常組不給任何處理。
　　 靜脈移植脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞:SD大鼠ADMSCs擴(kuò)增至第四代,用Brdu標(biāo)記。用于移植的第4代ADMSCs在進(jìn)行第4代傳代后培養(yǎng)基中加入10μmol/L的Brdu,培養(yǎng)3天后消化收集,用生理鹽水重懸,300萬/ml。實驗組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷24h后行ADMSCs尾靜脈移植,每只大鼠經(jīng)尾靜脈

14、注射間充質(zhì)干細(xì)胞3×10個。
　　 Morris迷宮檢測認(rèn)知功能的恢復(fù):從大鼠腦損傷后第11天至第14天行Morris迷宮檢測,每天檢測時間為上午9點至下午5點,記錄找到逃生平臺的時間(潛伏期)。檢測4天后,移動并暴露逃生平臺,記錄到達(dá)逃生平臺時間。
　　 Brdu免疫熒光檢測移植的ADMSCs在腦損傷區(qū)域的分布:從3組大鼠中每組取3只經(jīng)心臟灌注4％多聚甲醛后斷頭取腦,常規(guī)制成石蠟切片。以損傷區(qū)域為中心切成5μm切片,行

15、Brdu免疫熒光染色,了解移植的ADMSCs在腦內(nèi)的分布情況。
　　 BDNF和GDNF的定量檢測:每組9只剩余大鼠立即斷頭處死取腦,放入液氮中,行western-blot檢測BDNF和GDNF的相對含量。Kodak Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool 3.0處理,用BDNF/Actin 代表BDNF的相對表達(dá)量.用GDNF/Actin代表GDNF的相對表達(dá)量。

16、r>　　 四、結(jié)論
　　 1、通過這種酶消化方法獲得的SD大鼠ADMSCs具有成骨成脂多向分化能力,免疫表型分析顯示符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
　　 2、SD大鼠大網(wǎng)膜和腹股溝脂肪墊來源的ADMSCs均能成骨成脂分化,成骨成脂分化能力定量測定無明顯差別,免疫表型不完全相同。
　　 3、皮膚切口能引起皮下脂肪組織的ADMSCs收獲率降低,對獲得的ADMSCs在形態(tài)、多向分化性質(zhì)、增殖能力和表面標(biāo)志方面無明顯影響。<