人羊膜及臍帶來源間充質干細胞對創(chuàng)傷性腦損傷治療潛力的生物學特性比較.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）是一個世界性的公共衛(wèi)生問題。TBI不僅具有較高的患病率和致死率，而且是繼發(fā)性癲癇發(fā)病的一個重要原因，嚴重影響患者的生活質量。在我國，TBI是40歲以下成年人創(chuàng)傷性死亡的主要原因。即使有幸存活下來一部分TBI也將造成嚴重的神經功能缺失和行為能力的障礙，給家庭和社會造成極大的負擔。目前臨床主要采用對癥支持療法，另外采用積極的院前復蘇、快速分流、重癥監(jiān)護也有助于降低死亡率，但

2、這些治療方法仍不能達到令人滿意的效果。TBI在病理生理學上可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷兩個階段。首先原發(fā)性的機械性創(chuàng)傷會對局部的神經組織造成損害，而損傷本身隨后又會觸發(fā)一連串的級聯(lián)反應，包括神經組織缺血、繼發(fā)于彌漫性軸索損傷的Wallerian變性、興奮毒性、鈣穩(wěn)態(tài)失調、線粒體功能障礙和自由基介導的損傷等。繼發(fā)性的腦損傷常發(fā)生在頭部受傷后的數(shù)小時到數(shù)天的時間內。而且TBI之后神經元的喪失不僅僅發(fā)生在損傷局部而且可以彌散到其它腦區(qū)。局

3、灶性損傷典型的特征是損傷區(qū)周圍的灰質內或灰白質交界處的出血。這種局灶性的神經元死亡有兩種機制，迅速的細胞壞死和進程較慢的細胞調亡。彌漫性損傷則主要發(fā)生在海馬區(qū)神經元，海馬區(qū)的神經元對TBI的反應尤為敏感，在所有致命的TBI患者中有超過80％存在海馬區(qū)神經元的大量喪失，即使在沒有顱高壓存在的情況下亦是如此。這造成的直接后果便是導致實驗動物或患者記憶和認知功能的損害。當前對TBI治療方法的研究主要基于以上對繼發(fā)性腦損傷的病理生理、分子和細胞

4、機制的認識，包括占位性病變的早期發(fā)現(xiàn)和清除防止二次損傷，并嘗試通過藥物來減輕生化和細胞級聯(lián)反應造成的損害。人們普遍認為，成年人在損傷后刺激中樞神經系統(tǒng)再生將可能需要一個或多個以下的進程:細胞更換、提供神經營養(yǎng)因子、促進軸突導向和去除抑制軸突生長的因素、細胞內信號傳導的調控、橋接和材料、和/或調節(jié)的免疫反應。自從20年前哺乳動物大腦的神經元和星形膠質細胞具有自我更新的能力被證實以來，對中樞神經系統(tǒng)損傷的研究熱點逐漸轉入對神經生物學的研究，

5、例如細胞替代療法已經成為研究和商業(yè)活動的一大焦點。越來越多的證據(jù)表明，基于干細胞移植的治療方法可能是用于治療TBI后功能障礙的最有前途的治療策略之一。細胞替代療法以如下的治療理念為基礎，即創(chuàng)傷或疾病所引起的神經功能缺失可以通過引入新的細胞來替代喪失的神經元和膠質細胞，或者所引進細胞通過神經營養(yǎng)作用來增加受損的神經細胞的存活、可塑性和功能的恢復來發(fā)揮作用。迄今為止各種類型的干細胞，包括胚胎干細胞，神經干細胞和間充質干細胞目前正在被用于移植

6、研究來治療中樞神經系統(tǒng)損傷。胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）移植對大鼠的腦損傷功能恢復有治療作用，但是移植后的腫瘤形成限制了它在人體當中的應用。另外胚胎干細胞的應用存在明顯道德倫理障礙和胎兒組織來源不足等問題。最新的研究顯示誘導多能干細胞induced pluripotent stem cells，iPS）具有ESC的全能性，但是它同樣存在體內形成腫瘤的危險。神經干細胞(Neural stem cells，

7、NSC)是一個用來移植治療腦損傷理想的種子細胞，它既可以分化成神經細胞又可以分泌多種神經營養(yǎng)因子，但是大量神經干細胞的來源問題目前為止仍然限制了它的應用。人間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)被認為是一個很好作為腦損傷移植治療的備選細胞。在實驗和臨床研究中骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BM-MSC)是目前使用最廣泛的種子細胞。然而抽取骨髓是一個具有高

8、度侵入性的過程中，存在疼痛和感染的風險，而且其分化的潛能和擴增能力都會隨著年齡的增加而降低。因此尋找BM-MSC的替代細胞已經成為一個研究方向。來自胎盤，胎膜，羊水或胎兒組織細胞在細胞數(shù)量、擴張潛力和分化能力上都較成體組織來源的間充質干細胞更高。而且它們當中的一些細胞已經被用來研究治療神經退行性疾病和神經創(chuàng)傷性疾病。盡管胎盤來源的某些間充質干細胞已經被用來研究其對實驗動物某些神經系統(tǒng)疾病模型的治療作用，但是目前仍不清楚圍生期組織來源的各

9、種細胞對神經系統(tǒng)疾病的治療作用是否相同。在本研究中，我們將重點比較人羊膜來源間充質干細胞（amniotic membrane mesenchymal stem cells，AM-MSC）和臍帶華通膠來源的間充質干細胞(umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSC)的生物學特性，比較它們的形態(tài)、體外擴增能力、免疫表型、和多能性。鑒于神經干細胞是用來移植治療TBI一

10、個最理想的種子細胞，我們還比較了這兩種間充質干細胞的體外神經分化潛能，哪種細胞越容易的分化成神經干細胞，它就越適合作為治療TBI的種子細胞。細胞移植治療TBI，除了細胞替代以外，移植細胞提供的旁分泌功能也起到一定的作用。MSC被移植到腦損傷區(qū)域后可以提高損傷局部的神經營養(yǎng)因子濃度，這對受損細胞的存活和分化具有重要的意義。本實驗中我們使用人細胞因子抗體芯片檢測兩種來源間充質干細胞的507個細胞因子的表達。同時在兩種間充質干細胞的神經干的誘

11、導過程中，我們在體外檢測了對神經系統(tǒng)發(fā)育和重建具有關鍵作用的5個神經營養(yǎng)因子。它們是腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、神經營養(yǎng)因子3（neurotrophin3，NT-3）、膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell derivedneurotrophic factor，GDNF）和睫狀神經營養(yǎng)因子(cil

12、iary neurotrophic factor，CNTF)。這一結果將在一定程度上對于TBI損傷修復中種子細胞的選擇提供一定的參考，尤其是在神經營養(yǎng)因子分泌方面。同時這也反映神經干細胞誘導過程對不同細胞分泌神經營養(yǎng)因子能力的影響。另一方面移植入體內干細胞的存活能力也是干細胞移植治療需要考慮的重要方面。間充質干細胞的移植治療效果往往被植入細胞的大量損失所限制，細胞的死亡是由于損傷部位的惡劣微環(huán)境所引發(fā)。本研究中我們通過過氧化氫和去血清培

13、養(yǎng)兩種方式來模擬過氧化應激和局部的缺血缺氧環(huán)境，并比較了兩種來源間充質干細胞體外的抗凋亡能力?？沟蛲瞿芰姷母杉毎m合體內移植治療TBI。本研究包括三個部分：
　　 第一部分：AM-MSC和WJ-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　 目的：建立一種簡單有效的分離培養(yǎng)AM-MSC和WJ-MSC的方法，觀察其形態(tài)，檢測其表面抗原標記的表達情況，觀察培養(yǎng)過程中核型的變化，比較兩種細胞體外增殖能力，觀察其表面的細微結構，并檢測它們

14、中胚層多向分化能力。
　　 方法：對與羊膜細胞的分離我們采用2.4 U/mL中性蛋白酶、1.0 mg/mL膠原酶A和0.01 mg/mL脫氧核糖核酸酶依次消化來分離;對于華通膠細胞的分離我們采用Ⅱ型膠原酶和0.125％胰酶/EDTA依次消化的方法來分離。通過光學顯微鏡對細胞進行形態(tài)學觀察，并通過原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)對細胞表面的細微結構進行掃描。運用流式細胞術對兩種分離得到的細胞的

15、表面抗原進行檢測，并通過免疫細胞化學的方法對其表達神經干細胞標志的情況進行檢測。通過測定體外累積群體倍增來對兩種細胞體外增殖能力進行比較，并對體外培養(yǎng)的細胞進行核型分析。我們對兩種MSC的中胚層多向分化能力進行的檢測，包括向骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的分化能力。
　　 結果：通過上述的方法我們成功的分離培養(yǎng)出AM-MSC和WJ-MSC。兩種細胞都呈現(xiàn)成纖維細胞樣貼壁生長，相比之下WJ-MSC形態(tài)更加細長并具有更加強的折光性。對細

16、胞表面抗原檢測，我們發(fā)現(xiàn)兩種細胞的表達情況相類似，它們表達間充質干細胞的表面抗原(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105)，不表達血液和內皮系統(tǒng)的表面抗原（CD19、CD31、CD34和CD45），表達Ⅰ類抗原HLA-ABC但不表達Ⅱ類抗原HLA-DR。通過對兩種細胞向中胚層多向分化能力的檢測，發(fā)現(xiàn)兩種細胞都能夠向骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞方向分化。以上結果與國際細胞治療學會對間充質干細胞的定義和標準相符合，這說明

17、我們從上述組織中分離出的細胞符合間充質干細胞的特性。免疫細胞化學檢測結果顯示兩種細胞都強烈表達波形蛋白(100.00±0.00％ vs.100.00±0.00％)，少量的AM-MSC和WJ-MSC表達nestin(28.73±2.97％ vs.19.22±2.96％,t=2.265,P=0.053)、sox2(20.58±2.43％ vs.21.11±2.51％,t=0.154,P=0.881)和Musashi1(10.17±3.10％

18、vs.12.62±2.58％，t=0.609，P=0.559)，兩組之間nestin在AM-MSC中陽性率較高但差異無統(tǒng)計學意義。AFM掃描結果顯示，AM-MSC具有更強的粘附能力，在細胞的生長過程中邊緣胞體有更長的偽足伸出，這提示其可能具有更強的遷移能力。體外擴增實驗結果顯示，WJ-MSC具有更高的體外增殖能力（F=817.948，P＜0.001）。在細胞培養(yǎng)的各個階段我們都對細胞進行了核型分析，未發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)對其正常核型的產生影響。

19、
　　 結論：我們成功分離出AM-MSC和WJ-MSC，分離出的細胞符合MSC的標準，包括表面抗原的表達情況和中胚層多向分化的能力。AM-MSC具有更強的粘附能力，并可能有更強的體內遷移能力;而WJ-MSC則具有更強的體外增殖能力。兩種細胞在體外培養(yǎng)條件下都能保持正常的二倍體核型。
　　 第二部分：AM-MSC和WJ-MSC向神經干細胞分化能力的比較。
　　 目的：建立一種誘導AM-MSC和WJ-MSC分化為神經

20、干細胞的方法。通過這種方法我們想找到神經干細胞的新的來源，另外我們比較兩種來源間充質干細胞向神經干細胞的分化能力。檢測在誘導過程中神經營養(yǎng)因子表達量的變化情況。
　　 方法：間充質干細胞向神經干細胞分化的方法如下:AM-MSC和WJ-MSC培養(yǎng)在神經干細胞誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有KnockOutTM DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基、20 ng/mL人上皮細胞生長因子(human epidermal growth factor，EG

21、F)、20 ng/mL人成纖維細胞細胞生長因子(human beta fibroblastic growth factor，bFGF)、神經干細胞添加劑StemPro(@) NSC SFM和GlutaMAXTM-Ⅰ添加劑(1∶100)同時含有1％的青鏈霉素，在37℃和5％ CO2置于25 cm2超低粘附力表面的培養(yǎng)瓶中。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。誘導10天后，收集神經球通過實時定量PCR和酶聯(lián)免疫吸(enzyme-linked immu

22、noadsordent assay，ELISA)附實驗來檢測神經營養(yǎng)因子的表達水平。
　　 結果：AM-MSC和WJ-MSC可以被誘導成神經球（一種神經干細胞的生長方式），羊膜來源的神經干細胞（amnion derived neural stem cells，AM-NSC）和臍帶華通膠來源的神經干細胞(umbilical cord Warton's jelly derived neural stemcells，AM-NSC)。而

23、且這種誘導得到的神經球具有神經干細胞的大部分特征。免疫細胞化學結果顯示AM-MSC和WJ-MSC經過誘導之后表達三種神經干細胞的標志。經過神經干細胞誘導培養(yǎng)基誘導之后與未誘導的間充質干細胞相比，神經干細胞的標志表達明顯上調。細胞免疫化學具體結果如下:AM-NSC與AM-MSC相比表現(xiàn)更強的nestin、sox2和musashi熒光信號(nestin，92.05±2.75％vs.28.73±2.97％,P＜0.001;sox2,70.17

24、±3.16％ vs.20.58±2.43％,P＜0.001;Musashi(l)，66.94±3.62％ vs.10.17±3.10％，P＜0.001）;WJ-NSC與WJ-MSC相比表現(xiàn)更強的nestin、sox2和musashi熒光信號（nestin，83.57±2.60％ vs.19.22±2.96％,P＜0.001; sox2,71.17±3.63％ vs.21.11±2.51％,P＜0.001; Musashi,64.15±3

25、.81％ vs.12.62±2.58％，P＜0.001）。有意思的是誘導后AM-NSC與WJ-NSC相比表現(xiàn)更強的nestin熒光信號但sox2和musashi未見顯著差異(nestin，92.1±2.82％ vs.83.6±22.52％,P=0.0497; sox2,70.2±3.26％ vs.71.2±3.54％，P=0.816; Musashi1，67.0±3.67％ vs.64.0±3.89％，P=0.559）。實時定量PCR結

26、果和Western blot結果與免疫細胞化學結果一致。對兩種來源細胞的間充質干細胞在誘導前后分泌神經營養(yǎng)因子的能力的變化情況進行的檢測。我們檢測了BDNF、GDNF、NT-3、CNTF和NGF。具體的ELISA結果如下:AM-MSC分泌因子的情況，BDNF，109.51±15.26 pg/mL，GDNF32.85±14.21 pg/mL, NT-327.43±11.91 pg/mL, CNTF39.62±13.56 pg/mL和NGF

27、21.46±9.83 pg/mL;誘導之后AM-NSC分泌因子情況，BDNF，477.39±39.95 pg/mL, GDNF101.01±11.67 pg/mL, NT-3206.33±26.36 pg/mL, CNTF160.48±22.69 pg/mL和NGF185.23±23.59 pg/m。WJ-MSC分泌因子情況，BDNF,241.69±25.90pg/mL, GDNF16.21±10.01 pg/mL, NT-3172.3

28、5±25.20pg/mL，CNTF34.37±11.42 pg/mL和NGF105.59±18.24 pg/mL;誘導之后WJ-NSC分泌因子情況，BDNF，333.66±31.59 pg/mL，GDNF93.64±19.17pg/mL，NT-3122.46±20.02 pg/mL，CNTF231.28±22.07 pg/mL和NGF32.76±10.17 pg/mL。組間比較結果顯示誘導前WJ-MSC與AM-MSC相比表達高的BDNF

29、(P=0.006)、NT-3(P＜0.001)和NGF(P=0.002)。而有意思的是誘導后AM-NSC卻比WJ-NSC表達更高的BDNF(P=0.003)、NT-3(P=0.015)、CNTF(P=0.014)和NGF(P=0.009)。實時定量PCR的結果與上述的ELISA結果一致。
　　 結論：成功的將AM-MSC和WJ-MSC誘導為AM-NSC和WJ-NSC。這些誘導得到的NSC與未誘導的間充質干細胞相比表達更高的NSC

30、標志。誘導之前WJ-MSC和AM-MSC相比表達更多的BDNF、NT-3和NGF，然而誘導之后AM-NSC卻比WJ-NSC表達更高的BDNF、NT-3、CNTF和NGF。由此可見來自新生兒附屬組織不同部位的間充質干細胞對同一神經干細胞誘導方法的反應不完全相同，相比之下AM-MSC對神經干細胞誘導的反應更有利于神經營養(yǎng)因子的分泌。
　　 第三部分：AM-MSC和WJ-MSC體外細胞因子抗體芯片檢測和抗凋亡能力的檢測。
　　

31、 目的：運用人細胞因子抗體芯片對兩種來源間充質干細胞分泌細胞因子的能力進行檢測。通過過氧化氫和去血清培養(yǎng)誘導AM-MSC和WJ-MSC凋亡，并檢測其抗凋亡能力。
　　 方法：使用人細胞因子抗體芯片(Human L-507 Array，RayBiotech Inc.)檢測兩種間充干細胞所分泌的507種細胞因子。我們用化學發(fā)光的方法來探測膜上的信號強度，信號的強度通過光密度計來進行定量。對于數(shù)值差別在兩倍以上的因子，我們對其進行統(tǒng)計

32、學分析。我們選用陽性對照對來自各張膜的數(shù)值進行標準化。本實驗中采用2 mmol/L的H2O2和去血清培養(yǎng)來誘導細胞凋亡。誘導凋亡的細胞以末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸生物素缺口末端標記法(TUNEL)和Annexin V和propidine碘(PI)染色來進行測定。
　　 結果：細胞因子抗體芯片的結果如下:與WJ-MSC相比AM-MSC中檢測到有23種細胞因子高表達差異倍數(shù)在兩倍以上;而在WJ-MSC中有49種細胞因子

33、相對AM-MSC高表達差異倍數(shù)在兩倍以上。在AM-MSC中高表達的23種細胞因子中，有4種因子差異有統(tǒng)計學意義;而在WJ-MSC中兩倍以上高表達的49種因子，統(tǒng)計結果顯示差異沒有統(tǒng)計學意義。在AM-MSC中上調的4種因子為白細胞介素(interleukin，IL)或者白細胞介素的受體。具體的細胞因子如下:IL-6(t=3.546, P=0.038), IL-13 Ralpha2(t=3.336,P=0.045), IL-12 p70(t

34、=3.743,P=0.033), IL-22 R(t=3.187，P=0.0498)。H2O2誘導凋亡后，TUNEL法檢測AM-MSC和WJ-MSC細胞凋亡率(27.94±2.31％ vs.35.70±2.27％，t=2.401，P=0.043)，Annexin V/PI染色方法檢測細胞凋亡率(31.31±2.05％ vs.39.52±2.65％，t=2.448，P=0.040);去血清培養(yǎng)誘導凋亡后，Annexin V/PI染色方法檢