人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植治療大鼠顱腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 重型創(chuàng)傷性腦損傷的治療是目前世界范圍內(nèi)的一個(gè)難題。由于腦損傷后病理過程復(fù)雜，神經(jīng)元損傷的不可逆性，神經(jīng)系統(tǒng)本身的再生能力差等方面的影響，在治療方面面臨許多難題。目前傳統(tǒng)的治療方法不能從根本上逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元不可逆損傷這一病理機(jī)制，然而干細(xì)胞移植療法卻為這一醫(yī)學(xué)難題帶來了希望。近年來研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷具有一定的治療作用。其中人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞hADSCs(Human Adipose-Derived Stem

2、 Cells)較其他間充質(zhì)干細(xì)胞有取材方便、倫理限制少、易提取培養(yǎng)、可自體移植等優(yōu)點(diǎn)，且已有研究證明ADSCs在體外經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)后能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，故hADSCs有望成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷新的種子細(xì)胞。
　　 分離培養(yǎng)hADSCs，并進(jìn)行表面標(biāo)志CD29、CD44、CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR的檢測。探索hADSCs經(jīng)尾靜脈移植后，對(duì)急性創(chuàng)傷性腦損傷大鼠行為學(xué)以及損傷腦組織中GFAP、NSE和Nestine等

3、表達(dá)的影響。
　　 對(duì)象與方法:
　　 細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：無菌條件下取成人遠(yuǎn)隔病變部位的廢棄脂肪組織清洗、剪碎、消化、過濾制成單細(xì)胞懸液，最后將其移入含10％胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)及20g/L堿性成纖維生長因子(bFGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代。取培養(yǎng)至第四代的ADSCs細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀分析法檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物：CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-AB

4、C、HLA-DR。
　　 動(dòng)物模型的建立及分組：采用自由落體硬膜外撞擊法制作大鼠腦創(chuàng)傷模型。將大鼠分為移植組、對(duì)照組、和生理鹽水組。移植組于腦損傷48h時(shí)經(jīng)尾靜脈注射Brdu標(biāo)記的成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；對(duì)照組不作處理；生理鹽水組于腦損傷48h時(shí)經(jīng)尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。
　　 采用NSS評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況；倒置顯微鏡hADSCs在損傷腦組織內(nèi)的遷移情況；免疫組織化學(xué)法檢測大鼠受損腦組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白

5、、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和巢蛋白的表達(dá)
　　 結(jié)果:
　　 原代培養(yǎng)的hADSCs24h后即可觀察到細(xì)胞貼壁。48h后貼壁細(xì)胞逐漸伸展開，周圍有脂滴沉淀。所培養(yǎng)的hADSCs，均勻地鋪于培養(yǎng)界面上，生長均勻，形狀規(guī)則呈長梭形，且生長增殖情況良好。約第7d時(shí)，hADSCs約80％融合，此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代后th即可見細(xì)胞開始貼壁，貼壁細(xì)胞從圓形逐漸伸展為三角形、多角形、并逐漸變成梭形，均勻分布。經(jīng)過較短的潛伏期后開始增殖。

6、傳代后的細(xì)胞增值速度明顯較原代細(xì)胞快。
　　 CD29和CD44高表達(dá)，而CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR表達(dá)極低，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的一般情況。
　　 移植組與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，NSS評(píng)分7d時(shí)無差異，14d、21d、28d時(shí)移植組明顯低于其他兩組；在受損傷的腦組織周圍可發(fā)現(xiàn)經(jīng)Brdu標(biāo)記的hADSCs;移植組于移植后7d、14d、21d、28d時(shí)GFAP和NSE的陽性表達(dá)面積明顯低于對(duì)照組和

7、生理鹽水組，以細(xì)胞移植后14d差異最為明顯；移植組Nestin的陽性表達(dá)率在移植后7d開始增高，對(duì)照組和生理鹽水組未見明顯陽性表達(dá)；對(duì)照組和生理鹽水組在GFAP、NSE、Nestin的陽性表達(dá)方面無差異。
　　 結(jié)論:
　　 (1)經(jīng)過分離、培養(yǎng)的hADSCs符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原的一般情況。
　　 (2)經(jīng)尾靜脈移植后，hADSCs可以進(jìn)入受損大鼠的腦組織。
　　 (3)hADSCs對(duì)急性創(chuàng)傷性腦損傷