骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠酒精性癡呆及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.探索建立酒精性癡呆模型的最佳條件。
　　2.探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)移植治療大鼠酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)的療效及其機(jī)制。
　　方法:
　　1、以SD大鼠為研究對(duì)象，按數(shù)字隨機(jī)方法分為:①20％酒精(4ml/kg/d)灌胃28d組;②20％酒精(4ml

2、/kg/d)腹腔注射28d組;③20％酒精(4ml/kg/d)灌胃14d組;④20％酒精(8ml/kg/d)灌胃14d組;⑤20％酒精(12ml/kg/d)灌胃14d組;⑥生理鹽水(4ml/kg/d)灌胃28d對(duì)照組;⑦生理鹽水(4ml/kg/d)腹腔注射28d對(duì)照組;⑧生理鹽水(4ml/kg/d)灌胃14d。探索建立AAD大鼠模型最佳條件。
　　2、Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)逃避潛伏期(Escape Latency，EL)，以

3、測(cè)定大鼠癡呆程度。
　　3、HE組織化學(xué)染色檢測(cè)酒精性癡呆大鼠海馬齒狀回腦組織損傷形態(tài)學(xué)變化。
　　4、Hoechst熒光染色觀察、計(jì)數(shù)酒精性癡呆大鼠海馬齒狀回凋亡神經(jīng)細(xì)胞。
　　5、直接貼壁法分離、培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增BMMSCs。
　　6、流式細(xì)胞儀鑒定BMMSCs表面抗原CD90、CD29、CD34、CD45。
　　7、選擇最適合的AAD大鼠模型建立方法[(20％酒精(4 ml/kg·d)灌胃28d]，同

4、時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組評(píng)估模型。AAD模型建立1周后采用靜脈或立體定向移植途徑移植3×106 BMMSCs或PBS，Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)BMMSCs移植后EL改變。
　　8、各組大鼠腦組織HE、Hoechst33342染色觀察、計(jì)數(shù)BMMSCs靜脈移植或立體定向移植后腦組織海馬齒狀回形態(tài)和凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的變化。
　　9、免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠海馬齒狀回、CA1區(qū)、CA3各區(qū)BDNF的表達(dá)。
　　10、采用比色法檢測(cè)

5、大鼠血清T-SOD和GSH-PX活力。
　　結(jié)果:
　　1、與相應(yīng)生理鹽水對(duì)照組相比，20％酒精(4ml/kg·d)灌胃14d或28d組均可誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯損害，大鼠EL均顯著延長(zhǎng)(P＜0.05);而20％酒精(4ml/kg·d)腹腔注射28d、20％酒精(8ml/kg·d，中劑量)灌胃14d、20％酒精(12ml/kg·d，高劑量)灌胃14d等3組大鼠EL延長(zhǎng)與20％酒精(4ml/kg·d)灌胃28d組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、差異(P＞0.05)。
　　2、HE染色顯示各AAD模型組大鼠海馬齒狀回出現(xiàn)散在或局灶分布的異形神經(jīng)細(xì)胞。
　　3、Hoechst33342熒光染色顯示各AAD模型組大鼠海馬齒狀回的異形細(xì)胞呈局灶碎片、濃染的凋亡形態(tài)，與相應(yīng)對(duì)照組相比其凋亡細(xì)胞增多，與對(duì)照組相比酒精灌胃14d和28d增多均有顯著性差異(P＜0.05)，且隨著酒精灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，海馬齒狀回凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著增多(F=20.74，P＜0.001)。然而酒精對(duì)神經(jīng)細(xì)

7、胞凋亡的影響并不隨酒精劑量的增加而增加(P＞0.05)。
　　4、BMMSCs貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭形，流式細(xì)胞儀鑒定高表達(dá)CD29(98.6％)和CD90(80.4％)，低表達(dá)CD34(0.1％)和CD45(5.8％)。
　　5、與生理鹽水對(duì)照組相比，選擇20％酒精(4ml/kg·d)灌胃28d成功建立AAD模型，AAD模型組大鼠EL顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)。AAD模型大鼠BMMSCs靜脈或立體定向移植2周后與PBS移植組比較

8、，大鼠空間定向?qū)W習(xí)記憶功能顯著改善，MWM行為學(xué)檢測(cè)EL均顯著縮短。
　　6、BMMSCs尾靜脈移植和立體定向移植2周后與PBS移植組相比，AAD大鼠海馬齒狀回異性病理形態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞少且散在，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05);
　　7、與生理鹽水對(duì)照組比較，AAD模型組海馬DG、CA1和CA3區(qū)BDNF表達(dá)均降低，而與PBS靜脈或立體定向移植2周后AAD組比較，BMMSCs靜脈或立體定向移植2周后大鼠海馬DG、CA1

9、、CA3區(qū)BDNF表達(dá)均增高，且靜脈移植組CA1區(qū)BDNF表達(dá)增高有顯著性意義(P＜0.05)，定向移植組DG和CA1區(qū)BDNF表達(dá)增高有顯著性意義(P＜0.05);
　　8、與生理鹽水對(duì)照組比較，AAD模型組大鼠血清T-SOD和GSH-PX酶活力均降低，而BMMSCs尾靜脈移植或立體定向移植2周后AAD大鼠血清T-SOD和GSH-PX酶活力均增加，且靜脈移植組GSH-PX活力增加有顯著性差異(P＜0.05)，立體定向移植組大鼠血