脂肪間充質(zhì)干細胞治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、目的：本研究在體外通過改良兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)分離ADSCs并標(biāo)記，體外定向誘導(dǎo)ADSCs分化為成肌細胞。將ADSC移植至SUI大鼠的近端尿道，檢測了ADSCs移植后體內(nèi)形態(tài)和分布以及尿動力學(xué)變化，及尿道及其周圍組織形態(tài)學(xué)改變，觀察間充質(zhì)干細胞移植治療壓力性尿失禁大鼠是否有效可行，為壓力性尿失禁的組織工程學(xué)治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴采用改良兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)分離ADSCs，對連續(xù)傳代細胞進行計數(shù)并描繪生長曲

2、線；收集P3細胞，進行細胞表面抗原流式細胞術(shù)鑒定及成脂、成骨定向分化功能鑒定；⑵以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介對ADSCs進行轉(zhuǎn)染。⑶選用第2代ADSCs，經(jīng)5—氮雜胞苷體外定向向成肌細胞誘導(dǎo)分化。在倒置顯微鏡、透射電鏡下及激光共聚焦顯微成像下觀察細胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)。采用免疫細胞化學(xué)對誘導(dǎo)前后細胞進行Desmin檢測，采用RT-PCR和Western Blot方法對誘導(dǎo)后細胞sarcomeric、Des

3、min基因mRNA和蛋白表達的檢測。⑷以雙側(cè)陰部神經(jīng)離斷的方法，制備大鼠SUI動物模型。模擬人體尿動力學(xué)檢查的方法，測定實驗動物的最大膀胱容量(MBV)、腹壓漏尿點壓(ALPP)、最大尿道閉合壓(MUCP)、能性尿道長度(FUL)各項指標(biāo)，證實SUI動物模型制作成功。并通過HE染色、Masson特殊染色、Mallory特殊染色、電鏡超微結(jié)構(gòu)對大鼠尿道橫紋肌性括約肌的顯微解剖進行研究。⑸將建模成功的33只大鼠分成ADSCs移植治療組和培養(yǎng)

4、基注射對照組，以5×106個細胞/只的細胞數(shù)移植注射到大鼠尿道中下段3、9、12點。移植2周后進行尿動力學(xué)檢測，評價動物尿動力學(xué)變化情況。通過HE染色、Masson染色、Mal1ory染色及對尿道評價細胞移植后尿道周圍組織病理變化。同時對橫紋肌性括約肌的超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化觀察及采用肌肉分割法評估干細胞治療后控尿系統(tǒng)的修復(fù)。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察移植細胞存活情況，以及采用二次諧波(SHG)成像技術(shù)探測尿道周圍SHG峰值信號，定量評價膠

5、原蛋白含量的變化。
　　 結(jié)果：①體外培養(yǎng)的ADSCs主要呈梭形和多角形，細胞表達CD44、CD90，不表達CD34、CD45、CD106；細胞成脂、成骨定向分化誘導(dǎo)后油紅-O染色、茜素紅染色陽性。倒置相差熒光顯微鏡下，GFP轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs發(fā)出綠色熒光，熒光強度隨MOI值的增加而增強，但以MOI為8的病毒感染大鼠ADSCs熒光強度最強，傳至P3時GFP陽性細胞達82％-86％。②ADSCs經(jīng)5-Aza等誘導(dǎo)分化后其形態(tài)發(fā)生改

6、變，細胞大小不一致；在透射電鏡、激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)下觀察到，逐漸山長梭形變?yōu)槎嘟切渭靶切危毎砻嬗性S多微絨毛；細胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞漿內(nèi)可見肌絲樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)后細胞表達結(jié)蛋白Desmin。RT-PCR、Western Blot結(jié)果證實，誘導(dǎo)細胞結(jié)蛋白Desmin基因的表達明顯高于對照組(P＜0.05)。⑨雌性SD大鼠的尿道為一長約2.0 cm的管狀結(jié)構(gòu)。其組織結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次為環(huán)形橫紋肌層、環(huán)形平滑肌層、

7、縱行平滑肌層、致密結(jié)締組織層和上皮層。雙側(cè)陰部神經(jīng)離斷的方法能成功制造大鼠SUI模型。尿動力學(xué)檢測結(jié)果：模型建立后大鼠膀胱最大容量增加(0.89±0.04)ml(P＜0.01)，腹壓漏尿點壓下降(15.46±5.49)cmH2O(P＜0.01)，最大尿道閉合壓和功能性尿道長度亦下降(7.97±3.25)cmH2O、(0.69±0.32)cm(P＜0.01)。建模后尿道及其周圍組織形態(tài)學(xué)觀察：括約肌排列松散，部分肌肉有斷裂現(xiàn)象，肌層變??；

8、結(jié)締組織所占比重增加，膠原纖維稀疏，排列紊亂。④尿動力學(xué)檢測ADSCs移植后尿控功能變化，ADSCs治療后大鼠膀胱最大容量下降(0.78±0.35)ml，腹壓漏尿點壓增加(15.06±4.36)cmH2O，最大尿道閉合壓和功能性尿道長度亦增加(9.69±2.57)cmH2O、(0.69±0.32)cm，與對照組比較各指標(biāo)均有顯著性意義(P＜0.01)。ADSCs移植治療后可以使注射局部尿道肌層得到明顯的加強和增厚，括約肌形態(tài)及功能得到明

9、顯的改善，周圍結(jié)締組織緊密，支撐作用得到加強。橫紋肌肌肉分割分析顯示干細胞治療4周橫紋肌肌肉面積及其長短軸比值均得到明顯增加。移植治療后尿道周圍的膠原蛋白含量明顯高于對照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：⑴通過消化分離，percoll密度梯度離心和preplate差速貼壁技術(shù)，可以獲得純度較高的SD大鼠ADSCs。本實驗使用攜帶GFP基因重組的慢病毒成功高效地轉(zhuǎn)染了ADSCs，該方法為長期觀測ADSCs的體內(nèi)狀況創(chuàng)造了條件。⑵本

10、研究提示：在特定誘導(dǎo)條件下ADSCs能被定向誘導(dǎo)分化為成肌細胞；并為SUI的干細胞移植治療提供了新的思路。⑶本部分研究通過雙側(cè)陰部神經(jīng)離斷的方法，成功建立了SUI的動物模型，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。尿道橫紋括約肌呈封閉環(huán)形分布于雌性大鼠尿道的中外段，提示此處為控尿機制的主要部位。⑷ADSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠后能存活、分化而整合至宿主尿道括約肌，改善壓力性尿失禁大鼠的尿控功能，并且主要可能通過在體內(nèi)定向分化為肌細胞，增強尿道括約肌