骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)雌性大鼠壓力性尿失禁影響的研究.pdf

1、壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是指患者腹壓突然增加(咳嗽、大哭、噴嚏、體舉重物)時(shí),尿液不自主地由尿道口流出的現(xiàn)象.目前女性發(fā)病率約為15﹪-60﹪,是影響女性尤其是中老年女性生活質(zhì)量的主要疾病之一,特別是在我國,隨著人口進(jìn)一步老齡化,SUI越來越受到人們的重視.目前對(duì)于SUI的治療主要涉及兩大方面:非手術(shù)治療以及手術(shù)治療.非手術(shù)治療主要是通過體育鍛煉、生物反饋、藥物治療等手段改善病情,適

2、用于癥狀較輕的患者及年輕女性,使用范圍較窄.手術(shù)治療主要包括經(jīng)陰道尿道膀胱頸筋膜縫合術(shù)、經(jīng)恥骨后膀胱尿道懸吊術(shù)、無張力陰道懸?guī)g(shù)等.手術(shù)療效較好,然而諸如病人的選擇、手術(shù)技巧、病變情況等因素都直接影響手術(shù)治療效果, 同時(shí)手術(shù)創(chuàng)傷大,且手術(shù)中懸吊力度不易掌握,易出現(xiàn)矯枉過正,發(fā)生尿儲(chǔ)留.近幾年,注射治療以其安全、簡單、方便、創(chuàng)傷較小,在門診即可施行的優(yōu)點(diǎn)日漸引起了人們的重視,它是將藥物或化學(xué)制劑注射到后尿道或膀胱內(nèi)口周圍粘膜下及肌層中,使

3、尿道腔變窄、拉長和縮小,從而提高尿道阻力,關(guān)閉尿道內(nèi)口,以有效控制尿流.目前在注射治療中遠(yuǎn)期療效好、花費(fèi)成本較少、安全的組織材料仍待發(fā)現(xiàn).理想的填充試劑應(yīng)具有低免疫原性、無毒性、較低過敏原性、有效性、與局部解剖結(jié)構(gòu)相一致性且注射后與局部組織相結(jié)合只有很輕微的炎癥等特點(diǎn).骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能較好的滿足以上要求,其具有向成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的

4、潛能,且來源豐富,可在體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增,具有較好的同種異體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)能力,是一種良好的替代治療靶細(xì)胞.利用MSCs及其向成肌細(xì)胞方向分化的細(xì)胞進(jìn)行注射治療,具有安全、免疫排斥性小、低過敏原性等優(yōu)點(diǎn),相信在不遠(yuǎn)的將來可能會(huì)為壓力性尿失禁提供新的治療機(jī)會(huì).本研究通過將MSCs及經(jīng)5-Aza-CR誘導(dǎo)后的MSCs注射到壓力性尿失禁大鼠的后尿道以及膀胱內(nèi)口周圍粘膜下及肌層中,采用噴嚏負(fù)荷試驗(yàn)及尿動(dòng)力學(xué)檢查等方法研究以上述兩種細(xì)胞為介質(zhì)的注

5、射治療對(duì)雌性大鼠SUI的影響.主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:一、MSCs分離培養(yǎng)的研究:1.胎牛血清濃度的選定:分別選用含0﹪、5﹪、10﹪、15﹪和20﹪胎牛血清濃度的完全培養(yǎng)基,以MTT比色法分析不同血清濃度下MSCs生長增殖情況,發(fā)現(xiàn)10﹪和15﹪血清濃度比較適合MSCs生長.2.MSCs接種濃度的選定:分別以2、4、6、8、10、12、14、16×10<'5>個(gè)/ml的密度接種MSCs,以MTT比色法分析不同接種密度下MSCs生長情況

6、,發(fā)現(xiàn)以(8-10)×10<'5>個(gè)/ml的密度接種MSCs,其生長繁殖情況最好.3.原代MSCs形態(tài)觀察:MSCs細(xì)胞均勻散在分布,部分呈克隆樣生長,細(xì)胞形態(tài)以桿狀及梭狀為主,少數(shù)形態(tài)不規(guī)則.4.MSCs傳代細(xì)胞的觀察:傳代細(xì)胞經(jīng)過了滯留期、指數(shù)增長期及平臺(tái)期,傳1-4代的MSCs生長增殖較快、活性較好,并且形態(tài)較均一,傳5-10代的MSCs,生長增殖變慢,且形態(tài)開始變化,呈多角形、分叉狀,傳1-4代的MSCs期細(xì)胞可用于誘導(dǎo)、注射治

7、療的研究.二、MSCs向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究;1.誘導(dǎo)濃度的選定:分別選用0、1、3、5、10及20μmol/L濃度的5-Aza-CR作用于MSCs, 以MTT比色法分析不同濃度5-Aza-CR誘導(dǎo)后MSCs的增殖情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)5或10μmol/L濃度的5-Aza-CR為誘導(dǎo)MSCs分化增殖的最佳濃度.2.成肌相關(guān)蛋白的檢測:10μmol/L 5-Aza-CR誘導(dǎo)MSCs 8d后,部分MSCs開始表達(dá)desmin,15d后表達(dá)明顯增強(qiáng)

8、;誘導(dǎo)后11d,部分細(xì)胞開始表達(dá)myosin,19d表達(dá)明顯增強(qiáng).3.誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)觀察:通過10μmol/L 5-Aza-CR誘導(dǎo)傳兩代的MSCs,7d后發(fā)現(xiàn)長的多核細(xì)胞;10d后胞體增大,呈粗桿狀;15d時(shí)有肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn).三、注射誘導(dǎo)前后的MSCs對(duì)雌性大鼠SUI影響的研究:1.大鼠SUI模型的建立:以氣囊擴(kuò)張產(chǎn)后大鼠陰道的方法,模擬第二產(chǎn)程延長時(shí)胎頭對(duì)骨盆底以及下尿道的壓力,通過噴嚏負(fù)荷實(shí)驗(yàn)、尿動(dòng)力學(xué)檢查證實(shí)大鼠有SUI的發(fā)生.