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文檔簡介
1、研究背景:干細胞可用于治療女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI),而且目前正在進行有關的臨床試驗。然而,干細胞治療的作用機制并未闡明。
目的:本研究的目的是檢測骨髓間充質干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell,BM-MSC)及其分泌物對模擬產傷動物模型功能及結構的恢復作用。
方法:1、成年雌性大鼠BM-MSC獲取及定向分化
2、能力檢測。濃縮分泌物(Concentrated conditioned media,CCM)的獲取及微陣列蛋白檢測;2、模擬產傷動物模型的制備,包括陰道擴張(Vaginal distention,VD)和雙側陰部神經擠壓(Pudendal nerve crush,PNC);3、大鼠試驗包含兩個部分,第一部分含有三個組,分別是假損傷+生理鹽水尾靜脈注射(n=15),雙重損傷+生理鹽水尾靜脈注射(n=13),和雙重損傷+BM-MSC尾靜脈注
3、射(n=16)。第二部分含有三個組,分別是假損傷+濃縮普通培養(yǎng)基(concentrated control media,CM)腹腔注射(n=18),雙重損傷+CM腹腔注射(n=19),和雙重損傷+CCM腹腔注射(n=17)。手術三周后進行功能學及組織學檢測,功能學檢測包括漏尿點壓力(Leak point pressure,LPP),尿道外括約肌(External urethral sphincter,EUS)肌電圖(Electromyo
4、graphy,EMG),和陰部神經感覺支神經電位(Pudendal nerve sensory branch potential,PNSBP)檢測。組織學檢測包括彈性纖維蛋白染色,神經肌肉接頭(neuromuscular junction,NMJ)和陰部神經免疫熒光染色。
結果:1、從成年雌鼠股骨中獲取的骨髓在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),到第三代(Passage3,P3)時利用流式細胞儀分選細胞間黏附分子-1(Intracelluar
5、adhesion molecule,ICAM-1)陽性的MSC,然后使用綠色熒光蛋白(Green fluroscence protein,GFP)慢病毒載體感染MSC。體外培養(yǎng)的MSC用光鏡觀察主要呈梭形和多角形,連續(xù)傳代P8和P16后用流式細胞儀進行細胞表面標志檢測發(fā)現(xiàn)CD29,CD90,CD54和CD45等干細胞標志物表達均呈陽性,P16細胞進行脂肪形成和成骨形成定向分化檢測,脂肪形成培養(yǎng)到20-35天后用茜素紅S染色觀察分化程度,
6、成骨形成20-35天后用油紅O和蘇木紫染色觀察分化程度。P16骨髓間充質干細胞在無血清DMEM普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,使用低氧、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱。將獲得的上清液提取出來,置于離心過濾器中并在離心機中4000rpm離心75分鐘獲得濃縮50倍的終產物,然后用0.22um過濾器過濾獲取的CCM并儲存在1.5ml離心管中。CM使用無血清DMEM離心濃縮獲得,方法類似。CCM在注射前進行細胞計數和誘導分化試驗,結果顯示CCM中沒有細胞存在
7、并且使用CCM培養(yǎng)的MSC生長速度要顯著高于對照組。使用RayBio?大鼠蛋白抗體陣列檢測CCM中的蛋白組成發(fā)現(xiàn)了63種不同表達強度的細胞因子和趨化因子。
2、VD+PNC雙重損傷延遲了陰部神經和尿道的功能恢復,其中LPP,EUS EMG結果顯示到第三周時雙重損傷組顯著低于對照組,而VD和PNC單獨損傷組與對照組相比均無顯著差異,陰部神經橫斷(Pudendal nerve transection,PNT)組在損傷第六周時LPP
8、和EUS EMG仍顯著低于對照組?;谝陨辖Y果我們使用VD+PND雙重損傷模型作為本實驗研究模型。
3、雙重損傷+生理鹽水或CM注射組在第三周時LPP顯著低于對照組,說明尿道功能損傷和抗漏尿壓力降低。而接受MSC或CCM注射的雙重損傷大鼠三周后的LPP與對照組相比無顯著差異,說明MSC和CCM均能促進尿道功能恢復。EUS EMG振幅增加值(峰值-基礎值)在雙重損傷接受生理鹽水或MSC注射治療后均顯著低于對照組,EUS EMG振
9、頻和振幅增加值在其他各組中相比均無明顯差別,說明MSC和CCM并未促進EUS EMG的恢復。PNSBP振頻和振幅增加值(峰值-基礎值)在雙重損傷+生理鹽水或CM注射組均顯著低于對照組,而MSC或CCM注射組與對照組相比并無明顯差別,說明MSC和CCM均能促進模擬產傷后的神經功能恢復。組織學研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,雙重損傷三周后尿道外括約肌橫紋減少并且有肌肉萎縮現(xiàn)象。彈性纖維在對照組中表現(xiàn)為連續(xù)的長纖維,主要出現(xiàn)在尿道外括約肌外層,與括約
10、肌平行。雙重損傷三周后這些平行于括約肌的外層長纖維破壞并糾纏在一起,而括約肌內側的彈性纖維增加并與括約肌垂直。而MSC或CCM注射組在括約肌內側觀察到更多的新生彈性纖維,說明MSC和CCM均能誘導彈性纖維的合成。尿道NMJ免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)對照組中陰部神經軸突呈長直狀,所支配的運動終板呈單個聚集狀,且支配較好。雙重損傷三周后,接受生理鹽水或CM注射組的陰部神經軸突較細,所支配的運動終板無序且呈擴散狀,神經支配較差。而雙重損傷三周后,接受M
11、SC或CCM注射組的陰部神經出現(xiàn)多個側支,運動終板的無序和擴散程度較輕,說明MSC和CCM提高了神經肌肉接頭的恢復。陰部神經免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),對照組中神經纖維呈緊湊環(huán)狀,排列整齊。雙重損傷三周后,接受生理鹽水或CM注射組的神經纖維密度降低且形狀不規(guī)則。而雙重損傷三周后接受MSC或CCM注射組可同時發(fā)現(xiàn)正常和非正常的神經纖維,且其密度要高于前者,說明促進了神經的恢復再生。GFP免疫熒光染色并未在尿道和陰道組織中發(fā)現(xiàn)GFP標記的MSC。
12、r> 結論:1、從雌性大鼠骨髓中獲取的間充質干細胞可在體外成功培養(yǎng)。GFP慢病毒載體成功感染MSC,這為后續(xù)的MSC體內定位研究提供了條件。利用高速離心可獲得濃縮的MSC分泌物,蛋白質陣列分析發(fā)現(xiàn)了多種細胞因子和蛋白質,這為闡明干細胞治療SUI提供了新的思路。2、雙重損傷延遲了組織和功能的恢復,該模型可用于慢性SUI的研究。3、MSC和CCM均能促進尿道功能和神經的恢復,其作用主要通過纖維蛋白增加和神經肌肉功能恢復。該研究證明無需細胞
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