骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療潰瘍性結(jié)腸炎的實驗研究.pdf

1、目的： 潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis，UC)是一種原因不明的慢性非特異性結(jié)腸炎。其病情易復(fù)發(fā)，遷延不愈，可致嚴重并發(fā)癥，已成為臨床治療的一個難題。本病在歐美等國家常見，近年來我國該病的發(fā)病率有明顯增高趨勢。其確切的病因和發(fā)病機制至今尚不清楚，認為與免疫系統(tǒng)失常、遺傳易感性、環(huán)境及精神等多種因素密切相關(guān)。UC的治療方法有多種，但均療效不太令人滿意。國外有應(yīng)用干細胞移植治療UC的個案報道，但尚缺乏系統(tǒng)的實驗研究。

2、本文旨在通過將同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植入大鼠UC模型后，探討MSCs在大鼠UC模型結(jié)腸的定位情況；探討移植后大鼠UC模型血清中的TNF-α、IL-10含量的變化。從動物實驗角度探討MSCs移植治療UC的可行性。 材料與方法： 實驗對象選擇健康雌性的SD大鼠，約8周齡，體重約180-200g。隨機分為A組為UC模型移植組，B組為UC模型對照組，C組為酒精對照組。

3、A、B組均采用三硝基苯磺酸(TNBS)與酒精復(fù)合灌腸法建立UC模型，C組用酒精灌腸作為對照。用貼壁法以PBS-LDMEM培養(yǎng)基體外連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得雄性SD大鼠的MSCs。A組造模后24小時，將0.4ml含2×106個MSCs的細胞懸浮液經(jīng)尾靜脈注射于UC模型的大鼠體內(nèi)，同時B、C兩組亦于灌腸后24小時注射0.4ml的生理鹽水作為對照。分別于移植后第1天、第7天、第21天每組各取6、6、4只大鼠，手術(shù)切取遠端結(jié)腸組織，用于制作病理切片(H

4、-E染色)以觀察其形態(tài)學(xué)變化，以及用于檢測髓過氧化物酶(MPO)及提取DNA進行sry區(qū)段的檢測。后者經(jīng)PCR方法檢測Y染色體的性別決定區(qū)段(sry)作為定位的標(biāo)志，以確定MSCs的腸道定位情況。組織中的髓過氧化物酶活性用二甲氧基聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測。同時，經(jīng)腹主動脈無菌采血，提取血清，用于檢測血清中細胞因子IL-10和TNF-α的含量，以觀察炎癥因子的變化情況。 結(jié)果： 骨髓間充質(zhì)干細胞于培養(yǎng)后24小時內(nèi)貼壁，5～6

5、天后，貼壁細胞體積增大呈梭形，有粗大突起伸出，部分細胞呈多角形，除部分細胞單個散在外，細胞多數(shù)聚集成集落；10～12天左右細胞鋪成單層，排列成旋渦狀，呈梭形或多角形，傳代3次后即可移植。計數(shù)50mL體積培養(yǎng)瓶中細胞數(shù)目可達5×106個/瓶。經(jīng)流式細胞儀檢測CD44陽性率為89.58％，CD54陽性率為95.54％。 大鼠UC模型病理學(xué)上可見結(jié)腸粘膜的毛細血管擴張、充血、水腫，大量的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤。粘膜上皮細胞間有中性粒

6、細胞浸潤，腺體呈環(huán)狀，腺細胞減少或消失，有隱窩膿腫及潰瘍形成等一系列類似人UC的病理變化。A、B組的髓過氧化物酶(MPO)于第1天(A組：3.57±0.39，B組：3.33±0.56)、第7天(A組：2.38±0.59，B組：2.18±0.67)均較C組(第1天：1.15±0.39，第7天：0.84±0.40)明顯升高(p＜.05)。在B組，與第1天(3.33±0.56)相比，第7天(2.18±0.67)和第21天(1.49±0.39)

7、顯著增高(p＜0.05)，而第7天、第21天之間無顯著差異(P＞0.05)表明A、B兩組炎癥明顯，并于第7天炎癥達高峰，隨后降低。 移植后sry檢測顯示：第1天，第7天和第21天陽性率分別為0％(0/6)，16.7％(1/6)和50.0％(3/6)，而對照組均陰性。 A、B組血清TNF-α(A組：52.8±16.7，B組：53.6±10.5)與IL-10含量(A組：161.6±23.0，B組：153.6±12.8)于第1

8、天均較C組(C組TNF-α：28.6±7.8，IL-10：112.7±30.9)升高(p＜0.05)，但第7天(A組TNF-α：26.4±17.0，IL-10：133.7±10.3;B組TNF-α：36.8±12.7，IL-10：133.4±6.1)，第21天時(A組TNF-α：25.5±8.8，IL-10：133.7±13.2;B組TNF-α36.5±14.8，IL-10：128.9±31.2)均與C組(第7天TNF-α：30.4±1

9、0.2，IL-10：131.0±10.3;第21天TNF-α：31.3±9.4，IL-10：140.6±7.6)無差異(P＞0.05)，且A、B兩組在各時期比較均無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型血清中TNF-α的水平和IL-10的水平均于炎癥早期明顯升高。2.同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植后其能在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的腸道中定位。 3.骨髓間充質(zhì)干細胞移植后潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型血清