過表達(dá)CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢治療潰瘍性結(jié)腸炎及復(fù)方苦參湯的協(xié)同作用研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：CXCR4基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的：探討構(gòu)建大鼠趨化因子受體4（chemokine receptor4，CXCR4）基因過表達(dá)慢病毒載體的技術(shù)方法并檢測(cè)其體外表達(dá)目的基因的水平。
　　方法：設(shè)計(jì)CXCR4基因引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增CXCR4基因片段；用AgeⅠ酶切GV208載體；通過連接酶將CXCR4基因片段連接至線性化的GV208載體上；運(yùn)用PC

2、R方法鑒定陽性克隆的CXCR4-GV208載體；按GV208慢病毒包裝試劑盒說明書包裝慢病毒并運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)法行滴度檢測(cè)；然后用重組慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(293T細(xì)胞)，觀察GFP表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過PCR成功地?cái)U(kuò)增了CXCR4基因片段并連接到了GV208病毒載體上，通過PCR及DNA測(cè)序鑒定，證明CXCR4-GV208質(zhì)粒構(gòu)建正確，重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可觀察到熒光及蛋白表達(dá)。包裝過表達(dá)慢

3、病毒并測(cè)其濃縮滴度為2.0×108 TU/mL。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建CXCR4-GV208慢病毒載體，為CXCR4基因的后期研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分：SDF-1α/CXCR4軸促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢于實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎受損結(jié)腸及復(fù)方苦參湯的協(xié)同效應(yīng)
　　目的：調(diào)查基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1α）/趨化因子受體4（CXCR4）軸在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）治療2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的作用

4、及復(fù)方苦參湯的協(xié)同效應(yīng)。
　　方法：從SD大鼠骨髓中分離BMSCs并使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定。通過慢病毒技術(shù)使BMSCs表達(dá)GFP（Ad-GFP-BMSCs）或共表達(dá)CXCR4和GFP（Ad-CXCR4-BMSCs），Western blot檢測(cè)BMSCs轉(zhuǎn)染前后CXCR4蛋白表達(dá)。40只大鼠被隨機(jī)分成5組（n=8）：空白組、模型組、Ad-GFP-BMSCs組、Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組。采用TNBS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，尾靜脈

5、注射Ad-CXCR4-BMSCs或Ad-GFP-BMSCs，二聯(lián)組予復(fù)方苦參湯灌胃治療。細(xì)胞和中藥治療1 wk后收集結(jié)腸組織，免疫熒光或western blot檢測(cè)結(jié)腸部位GFP、CXCR4和SDF-1α表達(dá)。
　　結(jié)果：慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后BMSCs的存活率大約為90％，80％的BMSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP。相對(duì)于空白組，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸部位SDF-1α蛋白表達(dá)明顯上升。第12 d，Ad-GFP-BMSCs組結(jié)腸只能發(fā)現(xiàn)少量的綠色

6、熒光表達(dá)。相對(duì)于Ad-GFP-BMSCs組，Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組結(jié)腸部位則能發(fā)現(xiàn)綠色熒光表達(dá)顯著增多。類似的是，Western blot顯示Ad-GFP-BMSCs組結(jié)腸部位僅表達(dá)少量的GFP蛋白；相對(duì)于Ad-GFP-BMSCs組，Ad-CXCR4-BMSCs組結(jié)腸部位GFP蛋白表達(dá)量則明顯增多（P＜0.05）；相對(duì)于Ad-CXCR4-BMSCs組，二聯(lián)組GFP蛋白表達(dá)顯著提高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：SDF

7、-1α/CXCR4軸在BMSCs歸巢于受損的結(jié)腸組織中發(fā)揮重要的作用，復(fù)方苦參湯可能協(xié)同改善BMSCs的歸巢效率。這可能為潰瘍性結(jié)腸炎的細(xì)胞治療提供潛在的方法和理論依據(jù)。
　　第三部分：過表達(dá)CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的免疫機(jī)制研究
　　目的：調(diào)查過表達(dá)CXCR4的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療2，4，6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的效果及其潛在的免疫作用機(jī)制。
　　方法：從雌性SD大鼠骨髓中分離BMSCs

8、并使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定。通過慢病毒技術(shù)使BMSCs表達(dá)GFP（Ad-GFP-BMSCs）或共表達(dá)CXCR4和GFP（Ad-CXCR4-BMSCs），40只大鼠被隨機(jī)分成5組（n=8）：空白組、模型組、Ad-GFP- BMSCs組、Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組。采用 TNBS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，尾靜脈注射Ad-CXCR4-BMSCs或Ad-GFP-BMSCs，二聯(lián)組予復(fù)方苦參湯灌胃治療。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，每天記錄大鼠的DAI。治療1

9、 wk后，收集結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色和病理學(xué)分析。PCR檢測(cè)結(jié)腸部位IFN-γ、IL-6和Il-10的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)STAT-3和磷酸化STAT-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：相對(duì)于空白組，模型組結(jié)腸部位的IFN-γ、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)顯著上升，STAT-3及磷酸化STAT-3的蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05）。系統(tǒng)治療一周后，相對(duì)于模型組，Ad-GFP-BMSCs組大鼠的臨床癥狀及結(jié)腸病理損害

10、并沒有得到有效的緩解。相對(duì)于Ad-GFP-BMSCs組，Ad-CXCR4-BMSCs組和二聯(lián)組大鼠的DAI及病理炎癥分?jǐn)?shù)顯著降低，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯恢復(fù)。大鼠結(jié)腸組織的IFN-γ、IL-6的mRNA表達(dá)顯著下降，IL-10的mRNA表達(dá)顯著上升（P＜0.05）；STAT3及磷酸化STAT-3的蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：過表達(dá)CXCR4的BMSCs可能通過抗炎及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制來緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，這可能為BMSCs治療UC