IL-35基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題研究白介素35(interleukin35，IL-35)基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，并探討其作用機(jī)制。通過建立穩(wěn)定的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，經(jīng)尾靜脈注射IL-35基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察其對(duì)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果，探索出治療潰瘍性結(jié)腸炎新途徑。
　　一、 IL-35基因修飾C57BL/6小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞制備
　　目的:構(gòu)建IL-35過表達(dá)慢病毒載體，以其感染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，從而獲得IL

2、-35基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。方法:采用I型膠原酶消化法獲得小鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞，并以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)加以鑒定;應(yīng)用DNA聚合酶將IL-35基因連接入慢病毒工作質(zhì)粒，測(cè)序鑒定無誤后與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞獲得過表達(dá)IL-35慢病毒顆粒;以過表達(dá)IL-35慢病毒顆粒感染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)不同感染條件下細(xì)胞上清中IL-35的表達(dá)情況，從而獲得IL-35基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)

3、果:脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞獲取成功;過表達(dá)IL-35慢病毒載體可以成功感染間充質(zhì)干細(xì)胞，感染后細(xì)胞上清中IL-35蛋白濃度可達(dá)329.5±16.5pg/ml。
　　一、 C57BL/6小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型構(gòu)建
　　目的:建立C57BL/6小鼠急性潰瘍性模型。方法:應(yīng)用不同濃度葡聚糖硫酸鈉(DSS)喂養(yǎng)小鼠7日，每日記錄體重變化及一般情況改變，第8日處死小鼠，觀察結(jié)腸大體標(biāo)本;將結(jié)腸標(biāo)本石蠟包埋后切片檢查，HE染色評(píng)估病理改

4、變。結(jié)果:2％DSS可成功、穩(wěn)定誘導(dǎo)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度為4.10±0.03cm，較對(duì)照組6.17±0.10cm明顯縮短(P＜0.001)，第4日后，模型組較對(duì)照組體重明顯減輕(P＜0.05)。
　　三、 IL-35基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎保護(hù)作用的研究
　　目的:觀察IL-35基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞(IL-35-MSCs)對(duì)小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法:在DSS喂養(yǎng)

5、第2、4、6天尾靜脈注射IL-35基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，并與注射間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和生理鹽水(對(duì)照)的小鼠進(jìn)行對(duì)比;觀察不同組間小鼠一般情況及病理改變;采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealTime PCR)及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)對(duì)不同組小鼠結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)腸標(biāo)本中IL-17、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)情況和結(jié)腸固有層淋巴細(xì)胞(LPL)中CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分布情況。結(jié)果:①IL-35-M

6、SCs注射組小鼠體重下降趨勢(shì)較對(duì)照組變緩，但與MSCs注射組無明顯差異。②IL-35-MSCs注射組小鼠結(jié)腸標(biāo)本長(zhǎng)度(4.75±0.05cm)較MSCs注射組(4.06±0.04cm)及對(duì)照組(4.03±0.07cm)顯著變長(zhǎng)(P＜0.001)，病理評(píng)分顯著降低(P＜0.001)。③IL-35-MSCs注射組LPL中Treg分布(7.3±0.2％)較另外兩組顯著升高(P＜0.001)。IL-35-MSCs注射組小鼠結(jié)腸mRNA水平IL-