健脾補腎活血法對骨髓間充質干細胞移植治療結腸炎大鼠干預的研究.pdf

1、潰瘍性結腸炎(Ulcerativecolitis，UC)是以腹瀉、黏液膿血便、腹痛和里急后重等為主要癥狀，以結腸黏膜非特異性炎癥和潰瘍形成為病理特點的一種消化道疾病。因本病治愈難度大，復發(fā)率高，與結腸癌的發(fā)病關系密切，因此被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治疾病之一。目前的藥物治療主要包括水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制以及手術治療等，各種治療方法雖可緩解癥狀，但均存在一定的副作用和并發(fā)癥，病情易復發(fā)，多年遷延不愈，如何提高UC的療效，降低不良反應

2、，一直是臨床亟待解決的重要難題。祖國醫(yī)學認為，UC屬中醫(yī)的泄瀉、久痢、便血等范疇，實踐證明，中醫(yī)藥防治UC具有療效確切、不良反應少、安全持久的獨特優(yōu)勢，值得我們總結和研究。由于UC主要以結腸黏膜彌漫性損害(炎癥、糜爛、潰瘍等)為特點，修復損傷的結腸黏膜是治愈該病的關鍵。腸道黏膜上皮細胞終身不斷自我更新以維持其動態(tài)平衡，而這種動態(tài)平衡需要干細胞來調節(jié)細胞增殖、衰老及凋亡，由此可見腸道干細胞在維持腸道結構與功能的完整以及損傷后的修復中扮演著

3、重要角色。本研究將在中醫(yī)理論指導下，運用細胞及分子生物學技術和方法，比較及篩選不同中醫(yī)治法(健脾、補腎、活血)干預骨髓間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)修復UC結腸黏膜的作用，為進一步挖掘中醫(yī)藥臨床治療的有效方藥奠定基礎。 目的： 探討MSCs在治療UC中的作用，MSCs移植在結腸炎大鼠腸道的定位分化及不同中醫(yī)治法的影響，比較及篩選中醫(yī)藥的有效治法。 方法： 按照隨機分組的

4、原則，雌性SD大鼠分為正常組、模型對照組、MSCs移植組、參苓白術散組、金匱腎氣丸組、桃紅四物湯組，每組20只。另設一組同種系雄性SD大鼠20只作為MSCs體外培養(yǎng)來源，用免疫細胞化學方法鑒定其MSCs表型。動物造模，除正常組外，其余各組大鼠造模前禁食不禁水48h，禁食24h后以氯氨酮(100mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用硅膠管插入大鼠肛內約8cm，經管內注入5％2、4、6，三硝基苯磺酸(TNBs)水溶液0.4ml(100mg/kg)

5、加入50％乙醇0.25ml，約10s灌注完畢。造模后第二天將體外分離培養(yǎng)的雄性大鼠MSCs(2×106/ml個MSCs的懸浮液約0.4ml)經尾靜脈注射到雌性大鼠體內，分別給予不同中藥灌胃，按照實驗動物及人的體表面積比例換算，參苓白術散組劑量為30g/kg/只，金匱腎氣丸組大鼠藥物劑量為16g/kg/只，桃紅四物湯組劑量為12g/kg/只，均為每日1次，連續(xù)15天。療程結束后，取大鼠結腸組織，PCR擴增其MSCsY染色體的性別決定區(qū)段s

6、ry后凝膠電泳法檢測，免疫組織化學方法檢測其腸道干細胞標記物Musashi-1、端粒酶逆轉錄酶(TERT)，以及增殖細胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)的表達，觀察不同中醫(yī)治法代表方藥對MSCs在結腸炎大鼠腸道定植分化及細胞增殖作用的影響。 結果： (1)體外分離培養(yǎng)的雄性SD大鼠MSCs表型鑒定顯示CD44表達陽性，CD34表達陰性，符合MSCs特異性表型特征；大鼠UC

7、造模后，與正常組比較，各組大鼠腸黏膜損傷指數(shù)明顯升高，表明造模成功。 (2)經過中藥灌胃治療后，與模型對照組比較，MSCs移植組及中藥治療各組腸黏膜損傷指數(shù)均有減低，其中桃紅四物湯組較明顯降低黏膜損傷指數(shù)(P＜0.05)。 (3)經PCR擴增后，凝膠電泳可以檢測到結腸組織雄性性別特異性基因區(qū)段sry，MSCs移植組陽性率為20％，參苓白術散組陽性率為25％，金匱腎氣丸組陽性率為25％，桃紅四物湯組陽性率為35％。

8、 (4)免疫組化檢測到MSCs移植組及中藥治療各組大鼠結腸黏膜組織Musashi-1及TERT均有陽性表達，PCNA的表達有不同程度增強，其中桃紅四物湯組與MSCs移植組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。 結論： MSCs移植于結腸炎大鼠后，隨血循環(huán)到達結腸定位及分化，且可增強腸上皮細胞的再生。中醫(yī)健脾、補腎、活血法中藥對其有一定的促進作用，其中活血法代表方藥桃紅四物湯較明顯促進MSCs在結腸炎大鼠腸道定植、分化，以