大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的Exosomes對心臟干細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞移植治療心肌梗死(myocardial infarction, MI)已成為全球一大熱點(diǎn)。干細(xì)胞能夠促進(jìn)血管發(fā)生、恢復(fù)血供，再生梗死的心肌組織，促使心臟結(jié)構(gòu)和功能性恢復(fù)。目前研究報道，可供選擇的種子細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、胚胎干細(xì)胞（ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）、心臟干細(xì)胞（CSCs）等。其中，CSCs因更易向心肌系細(xì)胞分化，在治療MI方面被認(rèn)為具有巨大潛力。經(jīng)過多年的動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研

2、究，現(xiàn)已證實(shí)CSCs能夠促進(jìn)受損心肌的修復(fù)。然而，CSCs移植治療MI仍存在著一些困擾，即干細(xì)胞存活定植、分化能力欠佳。因此，為了增強(qiáng)CSCs的修復(fù)心肌的能力，目前報道的方法有多種，主要包括基因修飾、組蛋白修飾、缺氧預(yù)處理等?，F(xiàn)已證實(shí)BMSCs-Exosomes具有促進(jìn)MI區(qū)域血管發(fā)生、降低心梗面積的能力。另外，有研究報道乳腺癌細(xì)胞經(jīng)BMSCs-Exosomes刺激后，其遷移/侵襲能力明顯增強(qiáng)。利用BMSCs-Exosomes刺激CSC

3、s，是否能夠促進(jìn)CSCs活化、提高CSCs分化能力，增強(qiáng)CSCs心肌修復(fù)功能？這些問題目前仍未有研究報道。
　　本課題擬以Exosomes為手段預(yù)處理CSCs，旨在為提高CSCs的心肌修復(fù)功能；并進(jìn)一步通過microRNA基因芯片檢測，探討分析CSCs功能改善的基因調(diào)控機(jī)制。
　　第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，及Exosomes的提取
　　第一節(jié) MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：從大鼠的骨髓中分

4、離出具有多向分化潛能的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)。為進(jìn)一步獲取Exosomes作準(zhǔn)備。
　　方法：SD大鼠全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，多次傳代純化。對分離純化的MSCs進(jìn)行多方面鑒定：流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs表面標(biāo)記抗原的表達(dá)；繪制MSCs生長曲線；檢測MSCs的細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)14天左右，基本已鋪滿培養(yǎng)皿，融合達(dá)90％以上。傳代后，細(xì)胞增殖速度明

5、顯加快，4-6天即可傳代一次。細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈紡錘形。流式鑒定：超過90%BMSCs表達(dá)CD29、CD90和CD44，但不表達(dá)CD34。P3 MSCs生長曲線呈現(xiàn)：細(xì)胞接種后前2天為潛伏期生長；第3天，細(xì)胞開始增殖；第4、5、6天擴(kuò)增明顯加速，進(jìn)入對數(shù)增殖期；第7天增殖達(dá)到高峰，進(jìn)入平臺期。流式細(xì)胞儀檢測P3 MSCs細(xì)胞周期：G0/G1期占88.15%，G2期為1.73%，S期(G3)為10.12%，大部分細(xì)胞處于靜止期，符合干細(xì)

6、胞特征。
　　結(jié)論：利用大鼠全骨髓細(xì)胞，貼壁傳代培養(yǎng)，至P3可使MSCs得到純化，有效的培養(yǎng)出大鼠BMSCs。
　　第二節(jié) BMSCs來源Exosomes的提取、鑒定
　　目的：從P3BMSCs培養(yǎng)上清液中提取具有特定形態(tài)、大小和膜標(biāo)記物的Exosomes。為進(jìn)一步應(yīng)用Exosomes處理CSCs做準(zhǔn)備。
　　方法：應(yīng)用Exosomes提取試劑盒，按說明抽提P3 BMSCs培養(yǎng)上清液中的Exosomes。利用BC

7、A試劑盒測定Exosomes的濃度。對Exosomes進(jìn)行鑒定：透射電鏡下觀察Exosomes的大小、形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)鑒定Exosomes表面CD63的表達(dá)量；Western Blot檢測Exosomes中CD63的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：經(jīng)BCA試劑盒測定，Exosomes蛋白濃度較高，達(dá)1896.7mg/ml。對Exosomes鑒定：透射電鏡下觀察，Exosomes大小不一、圓形或橢圓形，呈囊狀小泡，腔內(nèi)可見低密度光亮區(qū)，平均

8、直徑為46.55±11.64(11-98nm)；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，CD63的表達(dá)量為96.7%；經(jīng)Western Blot檢測，CD63蛋白為陽性表達(dá)。
　　結(jié)論：試劑盒抽提的Exosomes濃度較高。經(jīng)透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot鑒定，符合Exosomes形態(tài)及特征。試劑盒抽提Exosomes簡便、省時、高效。
　　第二部分大鼠心肌梗死模型的建立
　　目的：氣管插管開胸直視下，行大鼠冠狀動脈前降支（

9、LAD）結(jié)扎，建立大鼠心肌梗死模型。
　　方法：17只SD大鼠，體重250g-300g，分為兩組：MI組（10只）和對照組（7只）。MI組在氣管插管下，開胸直視結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支（LAD）。判斷心梗模型是否成功建立：結(jié)扎前后檢測心電圖；術(shù)前、術(shù)后4周行多普勒超聲心動圖檢查；術(shù)后4周獲取大鼠心臟組織，行HE染色和Masson’s Trichrome染色分析。
　　結(jié)果：MI組大鼠手術(shù)成活率80%。冠脈結(jié)扎后，心電圖提示I、

10、II、III、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高明顯；MI建立后4周行心臟彩超檢查，EF和FS值較對照組均明顯降低（P<0.01, P<0.01）, LVEDD和LVESD較對照組均明顯增大（P<0.01, P<0.01）；HE染色，MI組可見肌纖維增粗變性、壞死，輪廓模糊；MT染色提示MI組有大量呈藍(lán)色的膠原沉積，存活紅色心肌少見。
　　結(jié)論：氣管插管開胸，直視下結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支（LAD），可以成功建立大鼠心肌梗死（MI）模型。

11、　　第三部分大鼠心臟干細(xì)胞(CSCs)的分選和培養(yǎng)
　　目的：利用免疫磁珠分選法（MACS），從新生3-5天SD大鼠心臟中獲取c-kit+心臟干細(xì)胞（CSCs）。為進(jìn)一步研究CSCs功能作準(zhǔn)備。
　　方法：獲得新生3-5天SD大鼠心臟，利用膠原酶消化和MACS分選法提取c-kit+CSCs，傳代培養(yǎng)。對分選的CSCs進(jìn)行鑒定：流式細(xì)胞術(shù)鑒定P0 CSCs c-kit陽性率；免疫熒光觀察CSCs中c-kit及Ki67的表達(dá)；C

12、SC經(jīng)誘導(dǎo)分化，免疫熒光觀察cTn I、Desmin、Connexin43、α-SMA、CD31的表達(dá)。
　　結(jié)果：應(yīng)用膠原酶和MACS分選法獲得的CSCs形態(tài)均一，呈小、亮、圓形或梭形，生長較緩慢。經(jīng)流式鑒定，c-kit+陽性率達(dá)91.5%；同時免疫熒光觀察到c-kit和Ki67呈陽性表達(dá)；經(jīng)誘導(dǎo)分化的CSCs，表達(dá)cTn I、Connexin43、Desmin、α-SMA和CD31熒光。
　　結(jié)論：利用MACS分選獲得的

13、CSCs純度較高，具有自我更新和向心肌系細(xì)胞分化的潛能，符合CSCs形態(tài)和特征。
　　第四部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的Exosomes對心臟干細(xì)胞功能以及心肌修復(fù)能力的影響
　　目的：觀察經(jīng)Exosomes處理后的CSCs在遷移、血管形成、擴(kuò)增能力等方面的功能變化，及其移植治療大鼠MI心肌修復(fù)的功能作用。
　　方法：首先，將DiI標(biāo)記的Exosomes加入CSCs培養(yǎng)基中，熒光觀察CSCs內(nèi)吞Exosomes；其次，

14、在不同濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的作用下，應(yīng)用CCK-8法觀察不同濃度Exosomes對CSCs擴(kuò)增能力的影響；應(yīng)用Transwell小室，觀察不同濃度Exosomes對CSCs遷移能力的影響；利用Matrigel基質(zhì)膠，觀察不同濃度Exosomes對CSCs血管形成能力的影響；然后，將經(jīng)400μg/ml Exosomes預(yù)處理的CSCs和正常培養(yǎng)的CSC

15、s局部心肌注射治療大鼠MI，觀察比較DiI-CSCs在心臟中短期存活的數(shù)量；免疫熒光觀察比較心梗周邊區(qū)域新生毛細(xì)血管密度和CSCs-GFP向血管分化的數(shù)量；心臟彩超檢查觀察比較心功能變化；MT染色觀察比較心梗面積差異。
　　結(jié)果：
　　（1）DiI標(biāo)記的Exosomes加入CSCs培養(yǎng)基中，觀察到CSCs表面呈現(xiàn)紅色DiI熒光，說明CSCs內(nèi)吞了Exosomes。
　?。?）在不同濃度Exosomes(0μg/ml,1

16、00μg/ml,200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的作用下，應(yīng)用CCK-8法檢測CSCs的增殖能力，呈現(xiàn)為低濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激，OD值變化不大；高濃度Exosomes組(200μg/ml,400μg/ml,800μg/ml)的OD值明顯高于低濃度組，但在高濃度Exosomes組的組間OD值無差異。應(yīng)用Transwell小室檢測CSCs的遷移能力，呈現(xiàn)為低濃度Exosomes(0

17、μg/ml,100μg/ml)刺激，CSCs遷移能力無顯著變化；但隨刺激濃度增加，其遷移能力顯著增加。應(yīng)用Matrigel基質(zhì)膠檢測CSCs血管形成的能力，呈現(xiàn)為低濃度Exosomes(0μg/ml,100μg/ml)刺激，形成Tube長度無顯著差異；但隨刺激濃度增加，Tube長度亦顯著增加，然而400μg/ml和800μg/ml組間Tube長度無差異。
　?。?） CSCs移植治療MI，CSCsExo組CSCs-DiI短期（10

18、天）存活量在心梗區(qū)域（IZ）和心梗周邊區(qū)域（BZ）均顯著多于CSCs組（P<0.01, P<0.01）；CSCsExo組和CSCs組大鼠在術(shù)后28天EF值均顯著高于Control組（P<0.01, P<0.01）；CSCsExo組BZ中新生毛細(xì)血管密度以及CSCs-GFP向血管分化的數(shù)目均明顯多于CSCs組（P<0.01, P<0.01）；CSCsExo組心臟纖維化面積和長度均顯著小于CSCs組（P<0.01）。
　　結(jié)論：在體外

19、實(shí)驗(yàn)中，BMSCs-Exosomes具有提高CSCs擴(kuò)增、遷移和血管形成的能力，并呈濃度依賴性；Exosomes對CSCs擴(kuò)增和血管形成能力的影響具飽和性，且Exosomes濃度在400μg/ml時可達(dá)到飽和狀態(tài)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Exosomes具有促CSCs存活、促新生毛細(xì)血管生成、促CSCs向血管分化，降低心梗面積，提高CSCs心肌修復(fù)的能力。
　　第五部分大鼠心臟干細(xì)胞的基因芯片分析及miRNA-326-5p在CSCs血管生成

20、中的作用
　　第一節(jié)大鼠心臟干細(xì)胞的基因芯片分析
　　目的：對CSCs組和CSCsExo組兩種不同狀態(tài)的CSCs行microRNA基因芯片檢測，找出差異microRNA進(jìn)行分析。
　　方法：采用Affymetrix基因芯片，對CSCs組和CSCsExo組(400μg/ml Exosomes預(yù)處理)兩組細(xì)胞行大鼠microRNA芯片表達(dá)譜檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。找出差異表達(dá)的microRNA，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　

21、結(jié)果：CSCs組和CSCsExo組經(jīng)microRNA芯片檢測，差異表達(dá)的miRNA有23個，其中5個顯著下調(diào)，17個顯著上調(diào)。miR-326-5p變化最為顯著，下調(diào)7.14倍。GO分析呈現(xiàn)：這些差異表達(dá)明顯的miRNAs，它們預(yù)測的靶基因參與的細(xì)胞生物功能較為廣泛，其中包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、正性調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增、內(nèi)吞、正性調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附、心臟發(fā)生、血管形成等。Pathway分析呈現(xiàn)：差異顯著miRNAs預(yù)測的靶基因參與廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其

22、中包括代謝通路、內(nèi)吞作用、Wnt信號通路、Hippo信號通路、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路、趨化信號通路等。miRNA-Gene-Network分析呈現(xiàn)：miR-326-5p, miR-328a-5p, miR-207, miR-760-3p, miR-702-5p這5個下調(diào)表達(dá)的miRNA，在網(wǎng)絡(luò)圖中它們的度(Degree)最高，分別為：166、177、188、189、120，即調(diào)控的靶基因數(shù)目最多。
　　結(jié)論：通

23、過基因芯片檢測，CSCs經(jīng)Exosomes處理后有23個miRNA表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中5個下調(diào)，17個上調(diào)。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，差異表達(dá)明顯的miRNAs，它們預(yù)測的靶基因參與的生物功能包括內(nèi)吞作用、VEGF信號通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、血管形成等，這些內(nèi)容中包含了本課題中觀察到CSCs經(jīng)Exosomes處理后發(fā)生變化的功能。miR-326-5p, miR-328a-5p, miR-207, miR-760-3p, miR-7

24、02-5p參與調(diào)控的靶基因最多，可能在本實(shí)驗(yàn)microRNA調(diào)控CSCs功能中占主導(dǎo)地位。
　　第二節(jié) miRNA-326-5p在CSCs血管形成中的作用
　　目的：進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA基因芯片結(jié)果中感興趣表達(dá)差異最大的miRNA-326-5p。并探究CSCs經(jīng)Exosomes處理后，血管形成能力的增強(qiáng)是否與miRNA-326-5p的表達(dá)變化有關(guān)？
　　方法：通過qRT-PCR技術(shù)，驗(yàn)證基因芯片結(jié)果中miRNA-326

25、-5p的表達(dá)情況。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miRNA326-5p inhibitors轉(zhuǎn)染進(jìn)CSCs，通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率；利用Matrigel基質(zhì)膠，觀察CSCs、CSCsExo(400μg/ml Exosomes處理)、CSCsmiR-326-5p i這三組Tube的形成能力。
　　結(jié)果：經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，miRNA-326-5p在CSCsExo組中的相對表達(dá)量為0.18±0.05，明顯受到抑制。miRNA32

26、6-5p inhibitors轉(zhuǎn)染CSCs，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證miRNA326-5p，相對表達(dá)量為0.32±0.08，抑制效率明顯超過50%。CSCsExo組和CSCsmiR-326-5p i組Tube長度顯著大于CSCs組，CSCsExo組和CSCsmiR-326-5p i組組間無差異。
　　結(jié)論：經(jīng)qRT-PCR檢測，miRNA芯片結(jié)果中miRNA-326-5p下調(diào)顯著得到證實(shí)。下調(diào)miR-326-5p的表達(dá)可促進(jìn)CSCs血