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文檔簡(jiǎn)介
1、低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境,如在妊娠的早期,胚胎的發(fā)育是處在低氧環(huán)境中的,成年哺乳動(dòng)物的腦組織和骨髓中的氧濃度約為1~4%,均為低氧環(huán)境。低氧可誘導(dǎo)大多數(shù)細(xì)胞或組織中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor1,HIF-1)的表達(dá),而HIF-1是細(xì)胞低氧反應(yīng)的核心調(diào)控因子,調(diào)控著一系列低氧相關(guān)基因的表達(dá)。 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell)是一類具有高度自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞。
2、它在治療常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病與缺血性疾病中具有潛在的價(jià)值。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow-deftvedmesenchymal stem cell,hMSC)是存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞。由于hMSCs的移植具有多向分化和不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)或程度較低的優(yōu)點(diǎn),目前被廣泛應(yīng)用于帕金森病等疾病的細(xì)胞移植和基因治療的研究。 本研究是建立在本實(shí)驗(yàn)室前期研究——持續(xù)性低氧(3%O<,2>)可以促進(jìn)rNSCs和
3、hMSCs體外增殖的基礎(chǔ)上,通過基因芯片檢測(cè)低氧時(shí)兩種干細(xì)胞差異表達(dá)基因的變化情況。通過生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)與功能,并試圖探討低氧促進(jìn)這兩種干細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。 1.低氧對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響: 1.1低氧后rNSCs中差異表達(dá)基因的數(shù)目和功能分類將來源于胚胎E14.5天的大鼠中腦神經(jīng)干細(xì)胞分別在低氧(3%O<,2>)和常氧(20%O<,2>)環(huán)境中培養(yǎng),基因芯片技術(shù)分析顯示了,低氧24h與72h
4、后,在5705個(gè)大鼠基因中有差異表達(dá)的基因共有131個(gè),其中24h時(shí)的差異表達(dá)基因數(shù)是71個(gè);72h差異表達(dá)基因數(shù)是62個(gè)。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因功能分類發(fā)現(xiàn):代謝類基因最多,其次是運(yùn)輸類基因、細(xì)胞分化及黏附類基因。 1.2 RT-PCR驗(yàn)證HIF-1靶基因和增殖相關(guān)的基因由于我們的前期實(shí)驗(yàn)證明了低氧促NSC增殖是有HIF-1參與的,我們對(duì)131個(gè)差異表達(dá)基因中,7個(gè)已知的HIF-1靶基因(ldha、aldoa、enol、ga
5、pdh、tpi1、pgk1、bnip3)和5個(gè)與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的基因(dnaja2、ccnbkl、tgfβ2、ccng1、rgs7)做RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示:這12個(gè)基因的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果同芯片結(jié)果的一致率為58.3%。 1.3生物信息學(xué)分析有可能是HIF-1靶基因的差異表達(dá)基因通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè),在除了已知的7個(gè)HIF-1靶基因以外的基因中,我們發(fā)現(xiàn)在24h有13個(gè)差異表達(dá)基因存在HIF-1的靶位點(diǎn),72h有1
6、2個(gè)基因存在HIF-1的靶位點(diǎn),可能也與HIF-1信號(hào)途徑有關(guān)。其中,PPPlcb是在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都有差異表達(dá)且有HIF-1靶位點(diǎn)的基因。 以上結(jié)果表明:驗(yàn)證后的7個(gè)HIF-1靶基因在24h與72h時(shí)都基本上調(diào)了,從而進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)室以往研究結(jié)論:HIF-1參與了低氧促NSC增殖過程。 2.低氧對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響: 2.1低氧后hMSCs中差異表達(dá)基因的數(shù)目和功能分類本研究亦對(duì)不同低氧時(shí)間內(nèi)
7、hMSCs芯片上的差異表達(dá)基因進(jìn)行計(jì)數(shù)和功能分類。結(jié)果顯示:hMSC基因芯片上共有21329個(gè)的基因,其中差異表達(dá)基因共有282個(gè),我們發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)差異表達(dá)基因最多。 在功能分類中結(jié)果顯示:代謝類基因最多,其次是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因、發(fā)育類基因和運(yùn)輸類基因。 2.2 RT-PCR驗(yàn)證HIF-1靶基因和連續(xù)變化差異表達(dá)基因本研究從282個(gè)差異表達(dá)基因中找出了4個(gè)已知的HIF-1的靶基因(pgkl、igfbp3、bnip3、tg
8、fβ3),和12個(gè)連續(xù)變化的基因(hac、bnip3、eests、ndrgl、nefl、tfrc、his1、ddr1、trib3、ahnak、tnfrsf11b、txnip)做RT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)了它們?cè)?6h與72h時(shí)變化最多??偟尿?yàn)證率達(dá)到84.6%。 2.3生物信息學(xué)分析有可能是HIF-1靶基因的差異表達(dá)基因我們對(duì)12個(gè)連續(xù)變化的基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)在這12個(gè)基因中有3個(gè)基因存在HIF-1的靶位點(diǎn),它們分別是:his1、t
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