骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、凍存及體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的骨髓中含大量成體干細(xì)胞，而且取材方便，成為成體干細(xì)胞研究焦點(diǎn)。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Marrow mesenchymal stem cells，MSCs）是繼造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell，HSCs）之后近年來研究較多的一種骨髓源多能干細(xì)胞。MSCs不僅具有強(qiáng)大的增殖分化能力，易于在體外大量繁殖，誘導(dǎo)分化，而且具有向胞外分泌多種細(xì)胞因子的特性，參與細(xì)胞微環(huán)境的構(gòu)建。體內(nèi)移植具有低免疫原性

2、，在器官移植、自身免疫性疾病及替代治療中有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 本文以SD(sprague-dawley)大鼠為實(shí)驗(yàn)材料，首先探討了MSCs的體外分離、擴(kuò)增的方法。取SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，采用全骨髓法貼壁培養(yǎng)MSCs，以梯度密度接種骨髓細(xì)胞。研究結(jié)果顯示，以0.5～1×107個(gè)/mL接種骨髓細(xì)胞可以有效縮短原代培養(yǎng)的時(shí)間，傳代細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，P2、P4、P6代生長曲線基本相同。免疫熒光法鑒定表面抗原CD29、CD44陽性表

3、達(dá)，不表達(dá)造血細(xì)胞系表面抗原CD34+。免疫熒光雙標(biāo)鑒定P3代細(xì)胞的純度，其CD29陽性率為97.96±0.35％，CD44陽性表達(dá)率為98.14±0.19％。
　　 上述結(jié)果充分證明本方法適于在體外快速獲得大量具有較高生物學(xué)活性的高純度MSCs。
　　 在此基礎(chǔ)上，對MSCs低溫凍存進(jìn)行了研究。以MSCs基本培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO為主要成分，設(shè)計(jì)不同配比的凍存保護(hù)液。以純化的MSCs（P3），1×106個(gè)/mL密度

4、，-80℃凍存7d后復(fù)蘇，臺盼藍(lán)據(jù)染法檢測復(fù)蘇率，結(jié)果顯示以80％DMEM+10％FBS+10％DMSO作為凍存保護(hù)液，復(fù)蘇率為61.00±3.61％，顯著優(yōu)于其余各組。復(fù)蘇后的細(xì)胞能夠在體外增殖，并正常傳代。依此方法凍存P4代MSCs，于凍存1、3、6個(gè)月后復(fù)蘇，復(fù)蘇率分別為61.67±4.41％、61.67±3.33％和65.00±11.54％，差異不顯著（P>0.05），復(fù)蘇后細(xì)胞增殖、傳代正常。對復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)的MSCs行免疫熒

5、光鑒定，其表面抗原CD29與CD44陽性表達(dá)，說明凍存后的MSCs仍可保持原有的生物學(xué)活性。
　　 此外，本實(shí)驗(yàn)還對MSCs旁分泌作用對NSCs分化的影響進(jìn)行了研究。以出生24h的SD大鼠乳鼠作為供體，分離、培養(yǎng)海馬源性NSCs，并誘導(dǎo)其分化；以免疫熒光法檢測NSCs 表面抗原Nestin，神經(jīng)元表面抗原NSE 及星形膠質(zhì)細(xì)胞表面抗原GFAP。研究結(jié)果表明，以無血清培養(yǎng)的方法聯(lián)合應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因可以使體外培

6、養(yǎng)的NSCs表現(xiàn)出良好的持續(xù)增殖能力，并且能夠穩(wěn)定地傳代擴(kuò)增，且傳代后的NSCs表達(dá)Nestin陽性。在去除培養(yǎng)液中的生長因子并添加10％ FBS后，NSCs能夠分化成為NSE陽性表達(dá)的神經(jīng)元和GFAP陽性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。在建立NSCs 培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)之上，以MSCs條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSCs分化，并以上述添加FBS的培養(yǎng)液作為對照，7d后行免疫熒光雙標(biāo)鑒定，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MSCs 培養(yǎng)液對NSCs 向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化具有促