兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、凍存及體外分化為胰島β細(xì)胞的研究.pdf

1、糖尿病作為嚴(yán)重危害人類健康的一類代謝性疾病，世界上患病人口逐年增多。胰島移植可以治療糖尿病，卻面臨著供體缺乏和移植免疫排斥問(wèn)題，細(xì)胞替代治療的可行性顯著，研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞(ESCs)、誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPS)以及成體干細(xì)胞(AS)可以體內(nèi)、外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，分化細(xì)胞可改善、逆轉(zhuǎn)糖尿病動(dòng)物的高血糖癥，為移植細(xì)胞替代治療糖尿病提供了可能性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)是存在于骨髓腔內(nèi)非造血干細(xì)胞類的成體干細(xì)胞，可以避免

2、利用胚胎干細(xì)胞涉及的倫理問(wèn)題和誘導(dǎo)性干細(xì)胞所產(chǎn)生的技術(shù)性問(wèn)題。如何誘導(dǎo)BM-MSCs穩(wěn)定、高效地分化為功能完全的胰島β細(xì)胞是目前亟待解決的問(wèn)題。本試驗(yàn)擬在體外分離培養(yǎng)兔BM-MSCs的基礎(chǔ)上，對(duì)凍存細(xì)胞的增殖能力、生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，優(yōu)化并建立穩(wěn)定的兔BM-MSCs體外定向分化為胰島β細(xì)胞的誘導(dǎo)方法與技術(shù)體系。
　　1.采用紅細(xì)胞裂解液法分離獲取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)，基于其貼附塑料基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)板生長(zhǎng)的特性體外擴(kuò)增培

3、養(yǎng)。通過(guò)觀察形態(tài)學(xué)，鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志，描繪生長(zhǎng)曲線等了解兔BM-MSCs生物學(xué)特性。紅細(xì)胞裂解液法操作簡(jiǎn)便、便于復(fù)制，能夠分離獲得高純度的兔BM-MSCs，細(xì)胞生物學(xué)特性穩(wěn)定，增殖活性好。
　　2.選取P1，P3，P9代細(xì)胞進(jìn)行凍存復(fù)蘇，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞復(fù)蘇率，觀察凍存時(shí)間(15d，30d，90d)對(duì)各代（P1，P3，P9代）細(xì)胞復(fù)蘇效果的影響;鑒定凍存細(xì)胞的增殖及生物學(xué)特性，向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化驗(yàn)證其干細(xì)胞多潛能分化特性。結(jié)果表

4、明凍存復(fù)蘇的兔BM-MSCs可繼續(xù)培養(yǎng)傳代，但其傳代次數(shù)有限;仍然具有多潛能干細(xì)胞特性，可以分化為脂肪細(xì)胞。凍存的兔BM-MSCs生物學(xué)性狀相對(duì)穩(wěn)定，同樣可以應(yīng)用于組織工程、細(xì)胞移植和基因治療等方面，為解決BM-MSCs的儲(chǔ)備、節(jié)省材料和時(shí)間提供依據(jù)。
　　3.本試驗(yàn)試圖利用DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza-dC)，探討甲基化程度降低是否可以增強(qiáng)胰島特異基因PDX-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰島細(xì)胞分化和β細(xì)胞的成熟。利用MTT法篩選出適

5、于誘導(dǎo)分化、且生長(zhǎng)損害作用相對(duì)小的DMSO濃度。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室先前篩選出5-Aza-dc適宜作用濃度為1μmol/L，DMSO聯(lián)合高糖誘導(dǎo)兔BM-MSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究基礎(chǔ);向不同誘導(dǎo)階段分別再加入5-Aza-dc聯(lián)合誘導(dǎo)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)對(duì)比，雙硫腙染色結(jié)果表明分化細(xì)胞均可產(chǎn)生胰島素，但是未檢測(cè)到胰島特異性基因PDX-1的表達(dá);試驗(yàn)未達(dá)到預(yù)期目的。表明，誘導(dǎo)方案仍需優(yōu)化。
　　4.本試驗(yàn)旨在優(yōu)化、建立兔BM-MSCs體外分化為

6、胰島β細(xì)胞的高效誘導(dǎo)技術(shù)體系，為細(xì)胞替代治療糖尿病提供足夠細(xì)胞來(lái)源、并為后續(xù)研究奠定部分理論基礎(chǔ)。利用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、B27、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、活化素A、尼克酰胺聯(lián)合高糖體外誘導(dǎo)兔BM-MSCs定向分化。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，雙硫腙特異性染色;免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)分化細(xì)胞內(nèi)PDX-1，Insulin蛋白表達(dá)情況;RT-PCR檢測(cè)與胰島β細(xì)胞分化、內(nèi)分泌功能相關(guān)基因(PDX-1，Insulin)的轉(zhuǎn)錄表達(dá);