大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其條件培養(yǎng)基對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：(1)建立新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSCs)的分離培養(yǎng)、體外分化、鑒定及體外長期培養(yǎng)的方法,并探討血清濃度對NSCs分化的影響。(2)觀察神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對骨髓間充值干細(xì)胞向類神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的影響。
　　方法：(1)取新生SD大鼠大腦組織,用無血清培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)NSCs。采用免疫熒光技術(shù)對NSCs進行鑒定,檢測其巢蛋白(Nestin)表達。用含有不同胎牛血清(fetal bovin

2、e serum,FBS)濃度(2％,5%,10%)的DMEM/F-12培養(yǎng)基誘導(dǎo)NSCs分化,分別用神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein2,MAP-2)抗體、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體行免疫熒光染色鑒定分化細(xì)胞。通過Western blot法檢測不同F(xiàn)BS濃度的分化條件下,MAP-2與GFAP的表達

3、情況。(2)提取大鼠神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基,濃縮后加到誘導(dǎo)液中,對所誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察和蛋白印跡實驗檢測,比較加入條件培養(yǎng)基的實驗組和未加入的對照組,間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞分化的情況。最后在通過免疫化學(xué)染色法鑒定誘導(dǎo)生成的類神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞是否能夠分化成為神經(jīng)細(xì)胞。
　　結(jié)果：(1)獲得大量未分化且懸浮生長的NSCs球,并能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。隨著血清濃度的增加,各組MAP-2的表達逐漸增加(P<0

4、.05),GFAP的表達逐漸減少(P<0.05)。(2)在加入神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)液后24 h,大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)開始改變,逐漸開始失去原有的梭形結(jié)構(gòu),至5d時形成大量貼壁生長的類神經(jīng)干細(xì)胞球樣細(xì)胞,兩組類神經(jīng)干細(xì)胞球進行免疫染色,均提示球內(nèi)大部分細(xì)胞表達Nestin(+)。利用圖像軟件進行分析,發(fā)現(xiàn)加入條件培養(yǎng)基的實驗組,神經(jīng)干細(xì)胞球數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05),實驗的細(xì)胞球直徑和面積也略大于對照組,但2組之間比較無統(tǒng)計學(xué)意義

5、(P>0.05)。蛋白印跡法檢測提示實驗組Nestin的蛋白表達量較對照組明顯增高(P<0.05)。在將誘導(dǎo)液更換為含2%B-27和5%FBS的培養(yǎng)基,兩組神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞均能分化成MAP-2(+)的神經(jīng)元和GFAP(+)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論：(1)應(yīng)用無血清培養(yǎng)技術(shù)可成功在體外培養(yǎng)出具有增殖、自我更新及多潛能分化能力的新生大鼠NSCs,可于含有不同F(xiàn)BS濃度(2%,5%,10%)的分化條件下進一步分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞