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文檔簡介
1、目的:①探討大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSCs)體外分離純化、擴(kuò)增、冷凍保存、5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標(biāo)記、誘導(dǎo)分化及其特征鑒定的方法.②以兒童骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells/bone mesenchymal stem cell,BMSCs)為來源途徑,探討在一定條件下誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的方法并對其生物學(xué)特征加以初步探索.為將來進(jìn)一步研究NSCs、BMS
2、Cs的生物學(xué)特性或探索治療脊髓栓系綜合征及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型提供證據(jù)和種子細(xì)胞.方法:①將14.5 d胎齡大鼠大腦額葉皮質(zhì)NSCs在無血清DMEM/F12(含20 ng/mL bFGF,20 ng/mL EGF及B27輔助培養(yǎng)液)培養(yǎng),利用有限稀釋法將懸浮生長的單個細(xì)胞所形成的克隆球挑選出來、通過亞克隆連續(xù)傳代大量擴(kuò)增的方法進(jìn)行純化;選取部分NSCs凍存、復(fù)蘇并用BrdU孵育,用血清或飼養(yǎng)層細(xì)胞加以誘導(dǎo)NSCs,采用免疫組化的方法
3、鑒定神經(jīng)組織細(xì)胞特異性抗原的表達(dá).②將兒童骨髓分離的BMSCs在α-MEM培養(yǎng)基(含20﹪胎牛血清,2mM谷氨酰胺,100U/ml盤尼西林,100mg/ml鏈霉素,25 ng/ml兩性霉素B)中進(jìn)行無分化培養(yǎng),誘導(dǎo)前24h加10ng/ml堿性成纖維生長因子(bFGF)入培養(yǎng)液中以促分裂,改換預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM+20﹪FBS+1mM 2-巰基乙醇)培養(yǎng)24 h后棄去預(yù)誘導(dǎo)液,然后加入含丁羥茴醚(Butylated Hydroxyani s
4、ole,BHA)作誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)液(組成成分為DMEM+2﹪DMSO+150μM BHA)進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng),逐日觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原nestin、神經(jīng)絲蛋白β-tublinⅢ和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的定性,觀察其表達(dá)情況;并采用RT-PCR技術(shù)對不同時段神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原nestin和神經(jīng)生長因子受體Trk B(neurotrophic receptor tyros
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