lif對(duì)人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖和分化的影響

1、 國(guó)才等 L I F對(duì)人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖和分化的影響 第 6 期 · 神 經(jīng) 內(nèi)分 泌 與 免 疫 ·L I F對(duì) 人胎 腦 神 經(jīng) 干 細(xì)胞 體外 增殖 和 分化 的影 響 尹國(guó)才 欒 佐 閆鳳青 屈素青 郭萬里 ( 海軍總醫(yī)院兒科 ， 北京 1 0 0 0 3 7 )· 4 4 9 ·中國(guó)圖書分類號(hào) R 3 2 9 ． 2 8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1 0 0 0 - 4 8 4 X (

2、 2 0 0 5) 0 6 - 0 4 4 9 - 0 6[ 摘 要】目的： 觀察 白血病抑制因子( 【) 對(duì)體外培養(yǎng)的人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響。方法 ： 用添加表皮生長(zhǎng) 因子( E G F ) 和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子 ( F G F 2 ) 的 N 2 培養(yǎng)基培 養(yǎng)人神經(jīng)干細(xì)胞 ( h N s c ) 。實(shí)驗(yàn)分添加 Ⅲ ( L I F) 組 和無 L I F( U r ‘ ) 組 ， 接種 1 2 天后計(jì)數(shù)細(xì)胞集落( 球)

3、 的形成率。傳代培養(yǎng)觀察 1 2 0 天 ， 定期進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù) ， 繪制生長(zhǎng)速率 曲線。取第 6代細(xì)胞球進(jìn)行分化誘導(dǎo) ， 免疫熒光技術(shù)鑒別神經(jīng)細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)志 ， 并計(jì)算各細(xì)胞類型間的比例。結(jié)果： 兩組集落形成 百分比分別為 ： L I F為 0 ． 5 0 ％ 一 0 ． 9 1 ％； L I F ‘ 為 0 ． 4 9 ％ ～ 0 ． 9 4 ％。兩組間的差 異并無 顯著意義 ( P>0 ． 0 5 ) 。在相同培養(yǎng) 條

4、件 下 ， 各例胎腦來源 的 N S C擴(kuò)增 速率 的相差 并無顯著性意 義( P>0 ． 0 5 ) ， 但 L I F對(duì) N S C擴(kuò)增有重要 作用 ， 刺激 細(xì)胞 擴(kuò)增 了約 40 o D ～ 84 0 0 倍 ， 無分化發(fā)生 ； L I F 一 組僅為 4 3 ～ 9 7 倍 ， 培養(yǎng)兩個(gè)月后可觀察到分化現(xiàn)象。在培養(yǎng)過程中觀察到 ： L I F 的作用主要 表現(xiàn)在細(xì)胞接種傳代約 5 0 ～6 o 天以后。用免疫細(xì)胞化學(xué)熒光

5、進(jìn)行分化細(xì)胞類 型鑒定 ， 計(jì)數(shù)神經(jīng)元和星形膠細(xì)胞數(shù)， 并計(jì)算其 中神經(jīng)元所 占的百分 比。L I F培養(yǎng)為 1 2 ％ ～ 8 3 ％， 明顯高于 L I F ‘ 組的 8 ％ ～ 2 3 ％( P0 ． 0 5 ) ． N os i g n i f i c a n td i f e r e n c e sw e r eo b s e r v e d D e t w e e nt hee x p a n s i o nf 0 1 d

6、 s0 f } l N S cd e r i v e d f r o mv a r i o u sf e t a lb r a i ns a mp l e s w h e nc u l t u r e du n d e rt h es a I l l ec on d i t i o m ． L I Fp h y e d g r e a tml e s o nc e l lp r ol i f e r at i o n ， i

7、nL I F + g r o u p s ， h NS Cc e l ln u mb e ri n c r e a s e dr a n g i n g f r o m 40 0 0 - 84 O Of o l d s ，n oc e ld i fe r en t i a t i o no c c u r r e d ； a n di nL I Fg r o u p s ， o n l y4 3t o9 6f 0 1 d s ．

8、T h ed i f e r e n t i a t i o np h e n o me n o m we r ewa t c h e dw h e nc u l t u r e dmo r et h a nt w omo n t h s ． I nt h eo 0 u r s eo f c e l lc u lt u ~ g ，o b s e r v e d t h a tt hee f e c t so f L I Fo nh

9、 NS Ce x p a n s i o nwe r eo b v i o u sl yd e mo n s t r a t e d5 0 - 6 0d a y sa f t e ri n o c u l a t i o n． T h en u mb e ro f l l e t l l D t k $a n da s t r o -c y t e s d i f e r e n t i a t e d f r o m t hec u

10、 l t u r e dh N S C w e r er e s p e c t i v e l y i d e n t i f i e db yme a f l so f I r m n u n o - c y t o ch e mi c a l f l u o r e s c e n ta s s a y ． a n dt h ep er c e n t a g e so fn e u r o l ~ ( a sap r o p o

11、 r t i o no fn e u i ~ na nda s t r c ey t en u m b e r )w e r ec a l c u l a t e d ， w h i c hw e r er a n g i n g f r o m1 2 ％ t o8 3 ％ i nL I Fc u l t u r e s ， s i g n ~一e a n t l yh i g h e rt h a n8 ％ t o 2 3 ％ i

12、nL I F —o n e s( P尸>0 ． O 1 ) 。 而 F B 1 0 、 F B 1 2和 s F B 2 3 各胎腦組織細(xì)胞 ， L I F和 L I F 一 兩 組 間 N S C集 落形 成百分 比 的差異 均無 顯 著性 意 義 ( P>0 ． 0 5 ) 。比較胎 腦 孕 期 對(duì) 集 落形 成 百 分 比 的影 響 ， L I F和 L I F 一 兩組間， 孕 1 O 周和 1 2 周問都無顯著性差

13、異( P> 0 ． o 5 ) ， 比較 孕 2 3 周胎 腦海 馬和紋 狀體 間 的集落 形成 百分 比影 響 ， 無 L I F情況下 ， 兩組織 間差 異無顯 著性意義 ( u=1 ． 5 6 79 ， P>0 ． o 5 ) ， 而 L I F海 馬組 織 N S C 集落形成百分比要顯著高于紋狀體 ( u= 3 ． 3 3 5 ，P 0 ． 0 5 ) 。按 各 時(shí)間點(diǎn) 獲得 的活 細(xì)胞 數(shù) ， 繪 制 出各胎 腦

14、組 織神 經(jīng) 干細(xì)胞 的生 長(zhǎng)曲線 ( 圖 5 ) 。從生 長(zhǎng) 曲線 可看 出培養(yǎng) 的前 6 o天 左 右 ， L I F的 作 用 并 不 很 明 顯 ： L I F和 L I F 一 各胎 腦 N S C擴(kuò)增 速 率幾 乎一 致 ， 之 后 ， L I F細(xì) 胞 量繼續(xù)保持 高速擴(kuò) 增 ， L I F的 四條生 長(zhǎng) 曲線 維持 原有 的上 升走 勢(shì) ， L I F 一 的 細(xì)胞 培 養(yǎng) 則 表 現(xiàn) 為滯 長(zhǎng) ，四條曲線 呈頂部平 臺(tái)

15、走 勢(shì) 。相 同的培 養(yǎng)條 件 下 ， 孕 1 0 周 、 1 2周和 2 3周 的胎兒腦組 織 的 N S C在體 外擴(kuò) 增 的速率 并 無 明顯 差異 ， 生 長(zhǎng) 曲線 走 勢(shì) 基 本 一 致 。形態(tài)學(xué) 觀察到 ： L I F 一 的 N S C ， 培養(yǎng) 到 6 o天后 ， 細(xì) 胞球 內(nèi)有 細(xì)胞 向外周遷移 ， 細(xì)胞形 態(tài)發(fā)生改變 ， 生出突起 ( 圖 6 ) ， 示神 經(jīng) 干細(xì)胞發(fā) 生 了分 化 。而 L I F細(xì)胞 球 仍 同

16、前期 。表 1 各胎腦組織集落數(shù)和細(xì)胞集落形成百分 比T a b ． 1T h ec o l o n yn u m b e r sd e r i v e df r o mt h ee mb r y o n i cb r a i nI J s s u e sa n dt h ec e l l u l a rc o l o n y - f o r m a t i o np e r c e n t a g e s ( C C F I P )N

17、 o t e ： 1 ) c o m o , ~ b e t w e e nL I Fa n dL I F 一 ； 2 ) v sF B 1 2 ： L I F 一， U=1 ． 0 9 89 ， P> O ． 0 5 ； L I F， U =1 ． 5 9 87 ， P> O ． 0 5 ； 3 ) v sh F B 2 3 ： L I F 一 ， u =1 ． 5 6 79 ， P>0． 0 5 ； L I F，

18、U =3． 3 3 5 ， P <0． 0 0 1 ．表 2 分化細(xì)胞 中神 經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的 比例 ( 神經(jīng) 元 ：星形膠質(zhì)細(xì)胞 ) 及神經(jīng)元所占百分比 T a b ． 2l l a f i ~ ( n e l 】 l r o n s ：c y t e s ) b e t w e e I It h eI i f r e 咖 a t e dn即舳 a I l d缸0 ‘a(chǎn) I l d t h e l ~ e e m a g

19、 e so fne I Ⅱo l 1 s蝴 gt I l 鋤 N o 【 e1 )c 0 rb e t w e ∞ L I Fa n dL I F 一； 2 )v sF B 1 2 ： L I F，=5 7 3 ． 9 6 ， P <O ． 0 0 5 ； L I F 一，=9 ． 8 4 ， P <O ． 0 0 5 ； 3 )、 r sh F B 2 3 ：L I F， Z=1 0 4 ． 9 6， P (O ． 0

20、0 5 ； L I F 一， Z=2 4 ． 7 7 ， P<O ． 0 0 5 ．2 ． 4L I F 對(duì) N S C分化 的影 響 細(xì)胞球 誘導(dǎo) 分化 后 ，免疫熒光 雙染 ( 紅色 T R I T e和黃綠 色 F r r c ) ， 隨機(jī)計(jì) 數(shù)一定視野 內(nèi) 10 0 0 個(gè)細(xì) 胞 中神 經(jīng)元 和 星形 膠質(zhì) 細(xì) 胞 的比例 ， 結(jié)果見表 2 。統(tǒng)計(jì) 顯示 ， 不 同孕期 的胎腦 和不 同的胎腦 組 織 ， 其 L I F培

21、 養(yǎng) 的神經(jīng) 元， 星形 膠 質(zhì)細(xì)胞 比例均 顯 著高于 I _ I F 一 培 養(yǎng) ( P< 0 ． 0 0 5 ) 。不 同孕期和不 同腦組織間 ， 比較分化細(xì)胞 中神經(jīng)元 與膠 質(zhì)細(xì)胞 的 比例 ， 結(jié) 果 顯示 ： L I F和 L I F 一 培養(yǎng) 的 N S C ，均表現(xiàn) 為 F B 1 0極 顯著 高 于 F B 1 2 ( P<0 ． 0 0 5 ) ， 海 馬 組織源性神 經(jīng)干細(xì)胞 分化 細(xì)胞 中， 神 經(jīng)