BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化及凋亡的影響.pdf

1、背景：
　　 1.關(guān)于PBDEs
　　 多溴聯(lián)苯醚是溴代類(lèi)化合物，常作為阻燃劑加到油漆，塑料，紡織，電子電器等人造產(chǎn)品中，目前已廣泛應(yīng)用于電子、電腦和泡沫等家具中。自20世紀(jì)70年代生產(chǎn)和使用多溴聯(lián)苯醚至今，已造成多溴聯(lián)苯醚的全球性環(huán)境污染。有資料顯示,發(fā)達(dá)國(guó)家80％的電子垃圾進(jìn)入中國(guó)、印度和巴基斯坦等國(guó),其中中國(guó)又占了90％，導(dǎo)致城市的戶(hù)外空氣中PBDEs濃度比農(nóng)村空氣中的10倍還多,在我國(guó)一些地區(qū)已形成了電子垃圾拆解

2、集散地,原始的拆解手段使PBDEs等持久性有毒污染物不斷向周?chē)尫?嚴(yán)重污染了當(dāng)?shù)丨h(huán)境,危害人體健康.
　　 由于PBDEs具有難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性和生物放大作用，能夠通過(guò)食物鏈的轉(zhuǎn)移，使生物受到毒害，最終導(dǎo)致對(duì)人體健康的危害。研究表明，20世紀(jì)80年代初以來(lái)，環(huán)境中和人母乳中多溴聯(lián)苯醚不斷以指數(shù)形式增加，這與全球PBDEs需求的增長(zhǎng)是一致的。PBDEs 在環(huán)境中能穩(wěn)定存在，并可沿著食物鏈傳播,最終通過(guò)食物、母乳、大氣

3、和室塵等蓄積在人體內(nèi).目前研究認(rèn)為，PBDEs進(jìn)入機(jī)體后多數(shù)積累在脂肪組織，對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生不良影響。PBDEs在鼠類(lèi)脂肪組織中的半衰期為19-119天，含溴越多的PBDEs同系物,半衰期越長(zhǎng)。
　　 多溴聯(lián)苯醚對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物有致癌性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和內(nèi)分泌干擾毒性，因此,在美國(guó)及歐洲等地，相繼限制生產(chǎn)和使用低溴類(lèi)如BDE-47,99,153等，但高溴類(lèi)如BDE-209因其阻燃性好，其生物毒性不確定而仍在廣泛使用。人們對(duì)PBDEs

4、 毒性的了解遠(yuǎn)不如PCBs。目前，實(shí)驗(yàn)室研究證據(jù)積累相對(duì)較多，而人群研究對(duì)象主要是職業(yè)人群，數(shù)據(jù)相對(duì)缺乏。不同職業(yè)的人群中PBDEs 同系物的分布不完全相同。對(duì)荷蘭，美國(guó)，瑞士及中國(guó)人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多溴聯(lián)苯醚產(chǎn)品中，非職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要BDE-153，職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要BDE-209和BDE-183。
　　 2.關(guān)于BDE-209
　　 十溴聯(lián)苯醚是一種含有十個(gè)溴原子的多溴聯(lián)苯醚，具有穩(wěn)定性好，添加量少，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)

5、，據(jù)統(tǒng)計(jì)2001年十溴聯(lián)苯醚在所有PBDEs中使用占83.3％，十溴聯(lián)苯醚排放到環(huán)境中后，經(jīng)光解、高溫分解、生物及微生物降解等過(guò)程，會(huì)轉(zhuǎn)化為多溴二苯并二惡英、多溴二苯并呋喃以及低溴代的聯(lián)苯醚，更容易進(jìn)入生物體，引起更強(qiáng)的毒性作用。試驗(yàn)也證明BDE-209具有神經(jīng)發(fā)育毒性，免疫毒性，內(nèi)分泌毒性以及致癌性等。
　　 3.關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞
　　 新記憶的形成，舊記憶的回想，學(xué)習(xí)能力的建立都與腦部海馬部位有關(guān)。
　　 本課

6、題從細(xì)胞水平,選取不同濃度的十溴聯(lián)苯醚作為目標(biāo)化合物,體外傳代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞，用不同濃度的BDE-209 對(duì)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行染毒，觀察神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài),檢測(cè)NSCs的增殖分化及凋亡狀況，以此來(lái)研究BDE-209 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響,探討神經(jīng)發(fā)育與環(huán)境因素的關(guān)聯(lián)，初步探討B(tài)DE-209 神經(jīng)毒性作用機(jī)制，本課題分為以下四個(gè)部分進(jìn)行各項(xiàng)具體實(shí)驗(yàn)。
　　 第一部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的

7、影響
　　 目的：
　　 取新生1天SD大鼠的海馬組織進(jìn)行無(wú)血清傳代培養(yǎng)，鑒別神經(jīng)干細(xì)胞的純度，染毒后測(cè)量形成神經(jīng)球數(shù)量及神經(jīng)球直徑，觀察BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.購(gòu)買(mǎi)新生1天SD大鼠，取大鼠海馬組織進(jìn)行體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2.培養(yǎng)3-4代后海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞鑒定及純度鑒別。
　　 3.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠

8、海馬神經(jīng)干細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液后，暴露于BDE-209，實(shí)驗(yàn)共分5組，空白對(duì)照組，DMSO對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為30ug/ml，實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個(gè)平行樣。DMSO對(duì)照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　 4.染毒72h后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行神經(jīng)球形態(tài)觀察，利用美國(guó)Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)形成神經(jīng)球的數(shù)目，

9、測(cè)量神經(jīng)球的平均直徑。
　　 結(jié)果：
　　 1.神經(jīng)干細(xì)胞鑒定結(jié)果：海馬組織培養(yǎng)經(jīng)3-5天可見(jiàn)神經(jīng)球形成,6-7后見(jiàn)神經(jīng)球逐漸增大，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)新形成的神經(jīng)球呈現(xiàn)Nestin免疫染色陽(yáng)性，提示所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2.海馬神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)3-4代后在倒置顯微鏡下觀察，由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞聚集形成大小不等的神經(jīng)球，折光性強(qiáng)，周?chē)鈺灻黠@，吹打成單細(xì)胞懸液后行免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的純度。

10、由結(jié)果可見(jiàn)分散的神經(jīng)干細(xì)胞是主體，可占90％以上。
　　 3．利用美國(guó)Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)形成神經(jīng)球的數(shù)目，測(cè)量神經(jīng)球的平均直徑可見(jiàn)：實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)神經(jīng)球數(shù)目明顯減少，且神經(jīng)球平均直徑明顯減小，隨著B(niǎo)DE-209濃度加大，神經(jīng)球數(shù)目減少，平均直徑減小。
　　 結(jié)論：
　　 所分離培養(yǎng)的細(xì)胞形成懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定是神經(jīng)干細(xì)胞。BDE-209可以導(dǎo)致新生鼠海馬細(xì)胞形成神經(jīng)球

11、數(shù)目及直徑改變，隨BDE-209濃度增加形成神經(jīng)球數(shù)目及直徑有不同程度的下降。
　　 第二部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：檢測(cè)BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響.
　　 材料與方法：
　　 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞暴露于BDE-209，實(shí)驗(yàn)共分5組，空白對(duì)照組，DMSO對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實(shí)驗(yàn)B組

12、：BDE-209濃度為30ug/ml，實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個(gè)平行樣。DMSO對(duì)照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　 2.經(jīng)MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)法，分別于24，48，72，96，120小時(shí)測(cè)定吸光度值3.繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn).對(duì)A值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.
　　 結(jié)果：
　　 MTT結(jié)果顯示細(xì)胞生長(zhǎng)總趨勢(shì)上升,隨著B(niǎo)DE-209作用劑量的增加，增殖能力下降，經(jīng)相關(guān)分析可見(jiàn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力

13、與一定程度的BDE-209 暴露劑量成負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 無(wú)血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的新生鼠海馬組織神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和增殖能力，BDE-209 可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力發(fā)生改變，隨BDE-209 濃度增加神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力有不同程度的下降,這可能是BDE-209 神經(jīng)毒性的作用機(jī)制之一。
　　 第三部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的研究
　　 目的：探討十溴聯(lián)苯醚對(duì)體外培

14、養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響.
　　 材料與方法：
　　 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞，在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并暴露于BDE-209，實(shí)驗(yàn)共分5組，空白對(duì)照組，DMSO對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為30ug/ml，實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個(gè)平行樣。DMSO對(duì)照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。隔天半量換液。
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15、.7天后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，并運(yùn)用美國(guó)Image-Pro-Plus6.0圖象分析軟件記數(shù)NF陽(yáng)性,GFAP陽(yáng)性,DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算NF+/DAPI+，GFAP+/DAPI+比例，并測(cè)量NF+細(xì)胞突起長(zhǎng)度。
　　 結(jié)果：
　　 NF+細(xì)胞比例及NF+細(xì)胞突起長(zhǎng)度隨著B(niǎo)DE-209濃度的增加而減少，GFAP+細(xì)胞比例隨著B(niǎo)DE-209濃度的增加而增加，存在劑量依賴(lài)關(guān)系.
　　 結(jié)論：
　　 BDE-20

16、9可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例發(fā)生改變，隨BDE-209濃度增加神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例有不同程度的下降，分化成神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度也有不同程度的下降。
　　 第四部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的研究.
　　 目的：
　　 觀察BDE-209對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞暴露于BDE-209，實(shí)驗(yàn)共

17、分5組，空白對(duì)照組，DMSO對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10ug/ml，實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為30ug/ml，實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為50ug/ml。每組設(shè)3個(gè)平行樣。DMSO對(duì)照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。24h后進(jìn)行檢測(cè)。
　　 2.采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 不同濃度的BDE-209作用24 h 后，均可致神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。實(shí)驗(yàn)A,B,C組作用2