低劑量BDE-209單獨(dú)和與BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的影響.pdf

1、【背景】
　　1.多溴聯(lián)苯醚（Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs）
　　多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers，PBDEs)是一類(lèi)溴代化合物，由于阻燃效率高、成本較低常作為阻燃劑添加到樹(shù)脂、油漆、聚氨酯泡沫和聚苯乙烯等高分子合成材料中，廣泛地應(yīng)用于紡織品、塑料制品、電子電器和建筑材料等領(lǐng)域。早在1960年開(kāi)始生產(chǎn)和使用多溴聯(lián)苯醚，直到1981年瑞典發(fā)現(xiàn)多

2、溴聯(lián)苯醚是一種環(huán)境污染物。多溴聯(lián)苯醚現(xiàn)已成為全球環(huán)境中普遍存在的污染物。有資料顯示,大概80％的電子洋垃圾被運(yùn)送到中國(guó)、印度等亞洲國(guó)家，而運(yùn)送到中國(guó)的就占了90%。
　　由于多溴聯(lián)苯醚和多氯聯(lián)苯醚（PCBs）具有相似的特征：難降解性、環(huán)境穩(wěn)定性、高脂溶性、遠(yuǎn)距離遷移性和生物放大效應(yīng)，能通過(guò)食物鏈傳播，通過(guò)食物、大氣、母乳和室內(nèi)灰塵等在人體內(nèi)蓄積，最終可危害人類(lèi)的健康。PBDEs作用的主要靶器官是神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、脂肪組織和甲狀腺

3、等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)多溴聯(lián)苯醚有神經(jīng)發(fā)育毒性、生殖毒性、免疫毒性和內(nèi)分泌干擾毒性及潛在的致癌性。因此,在歐美等國(guó)家已限制生產(chǎn)和使用低溴類(lèi)PBDEs，但一些高溴類(lèi)PBDEs，如BDE-209因其阻燃性好，生物毒性不確切而仍被廣泛使用。目前人們對(duì)PBDEs毒性的了解還遠(yuǎn)不如PCBs。實(shí)驗(yàn)室研究證據(jù)積累相對(duì)較多，而人群研究的對(duì)象主要是職業(yè)人群，數(shù)據(jù)相對(duì)缺乏。職業(yè)不同的人群中PBDEs同系物的分布也不相同。對(duì)中國(guó)、荷蘭、美國(guó)及瑞士人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，非職

4、業(yè)暴露人群體內(nèi)主要為BDE-153，職業(yè)暴露人群體內(nèi)主要為BDE-209和BDE-183。在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，多種污染物是同時(shí)存在，同時(shí)起作用。
　　2.十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）及四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）
　　十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）是一種含有十個(gè)溴原子的多溴聯(lián)苯醚，具有穩(wěn)定性好，添加量少，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)，我國(guó)不僅是PBDEs的生產(chǎn)、使用和出口大國(guó)，而且還是接收電子垃圾的大國(guó)，其中BDE-209的生產(chǎn)使用量最大，因此BD

5、E-209已成為我國(guó)重要的環(huán)境污染物。BDE-209在生產(chǎn)、使用和廢物處理過(guò)程中通過(guò)一系列遷移轉(zhuǎn)化進(jìn)入沉積物、大氣、生物固體及生物體中。進(jìn)入生物體后，十溴聯(lián)苯醚可代謝為低溴聯(lián)苯醚、多溴二苯并呋喃及溴二苯并二噁英，引起更強(qiáng)的毒性效應(yīng)。研究證明BDE-209具有神經(jīng)發(fā)育毒性、肝臟毒性、甲狀腺毒性、生殖毒性以及致癌性；母體內(nèi)的BDE-209也可通過(guò)胎盤(pán)及乳汁傳遞給胎兒。但也有學(xué)者認(rèn)為BDE-209在體內(nèi)的代謝快，蓄積低，在常規(guī)暴露水平下對(duì)機(jī)體

6、不造成影響。鑒于此，對(duì)于BDE-209的生物毒性的進(jìn)一步研究是很有必要的。
　　四溴聯(lián)苯醚（BDE-47）也是PBDEs的主要同系物之一，與BDE-209同是近年環(huán)境中含量增長(zhǎng)較快的持久性環(huán)境有機(jī)污染物。有研究報(bào)道示珠三角土壤中PBDEs污染嚴(yán)重，含量較高主要是BDE-209，BDE-47次之。由于BDE-209作為高溴化合物在體內(nèi)代謝時(shí)可轉(zhuǎn)化為BDE-47，轉(zhuǎn)化過(guò)程中二者比例可發(fā)生不同變化。也有研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209的作業(yè)人群

7、體內(nèi)存在高含量的BDE-209和相對(duì)較低含量BDE-47，停止暴露三年后，血樣本中BDE-209的含量顯著下降，但BDE-47含量并未發(fā)生明顯改變，這一變化對(duì)生物體影響正是我們要關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，開(kāi)展BDE-209與BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)生物體影響的研究十分必要。
　　3.神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSCs)
　　神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是干細(xì)胞的一種，是存在于腦和脊髓中未分化的細(xì)胞，與其他干細(xì)胞一樣，神經(jīng)

8、干細(xì)胞也具有自我更新、分裂增殖及多樣分化的特點(diǎn)，它能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞，屬于專(zhuān)能干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，為中樞神經(jīng)性的重建和神經(jīng)的再生提供了一個(gè)新的思路，為學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的視點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物胚胎期，神經(jīng)干細(xì)胞主要分布在海馬、嗅球、小腦、大腦皮質(zhì)、腦室下區(qū)和側(cè)腦室(室管膜上皮)；在成年后主要存在于海馬、紋狀體、腦室區(qū)、腦室下區(qū)及嗅球等部位。目前，NSCs研究的核心問(wèn)題是NSCs增

9、殖和分化的調(diào)控，研究表明，NSCs的增殖及分化的調(diào)控受多種因素的影響，有外源性因素(細(xì)胞因子和微環(huán)境)和內(nèi)源性因素(基因)共同調(diào)控，其中起著決定作用的是內(nèi)源性因素。
　　個(gè)體發(fā)育是由干細(xì)胞不斷分化形成功能細(xì)胞的過(guò)程，而神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也是胚胎干細(xì)胞不斷分化成神經(jīng)干細(xì)胞、再分化成神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)程，這分化過(guò)程任何一環(huán)節(jié)受影響均可導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少，從而引起神經(jīng)功能缺陷。腦是由神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)不斷增殖、分化而最終形成。神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)對(duì)稱(chēng)分裂進(jìn)行

10、自我更新，維持細(xì)胞種群，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)分裂完成細(xì)胞分化，而外來(lái)化學(xué)物能夠影響神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新潛能和發(fā)育分化的方向選擇。
　　4.蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）
　　蛋白質(zhì)組(Proteome)是指一種細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是以基因組編碼的所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平及整體水平研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，從而深入認(rèn)識(shí)有機(jī)體的多種病理生理過(guò)程。蛋白質(zhì)組學(xué)一詞源于蛋白質(zhì)

11、（protein）與基因組學(xué)（genomics）兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)，這個(gè)概念最早是由Marc Wilkins在1995年提出的。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能

12、為人類(lèi)健康事業(yè)帶來(lái)巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命進(jìn)入后基因時(shí)代的特征。
　　由于NSCs分化過(guò)程中有眾多的蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子的參與和消失,探索其功能和機(jī)制的過(guò)程是極其復(fù)雜和龐大的,而蛋白質(zhì)組學(xué)具有規(guī)模大和高通量等優(yōu)點(diǎn),與基因組學(xué)、生物信息學(xué)互相滲透、互相補(bǔ)充。PBDEs可影響NSCs的增殖和分化，但是其影響機(jī)制尚未完全闡明，因而本課題從細(xì)胞水平,給予體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞低劑量BDE-209及BDE-47聯(lián)合暴露，研究BDE-209

13、及BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)神經(jīng)干細(xì)形態(tài)學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的影響，以更全面地了解BDE-209及BDE-47神經(jīng)發(fā)育毒性的影響關(guān)鍵點(diǎn)，更深入地了解PBDEs與先天神經(jīng)發(fā)育異常的關(guān)系，為臨床上對(duì)PBDEs引起的神經(jīng)發(fā)育異常進(jìn)行有效地檢測(cè)和預(yù)防提供理論依據(jù)。本課題分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行各項(xiàng)具體實(shí)驗(yàn)。
　　第一部分低劑量BDE-209單獨(dú)和與BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的影響
　　【目的】
　　取24小時(shí)內(nèi)新生SD

14、大鼠的海馬組織進(jìn)行無(wú)血清傳代培養(yǎng)，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定和純度檢測(cè)，染毒后分別測(cè)量形成神經(jīng)球數(shù)目及神經(jīng)球直徑，觀察BDE-209單獨(dú)和與BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)24小時(shí)內(nèi)新生SD大鼠，取大鼠海馬組織進(jìn)行體外神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　2.對(duì)培養(yǎng)3-4代后的海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定及純度檢測(cè)。
　　3.將傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞吹打

15、成單細(xì)胞懸液，之后進(jìn)行BDE-209及BDE-47染毒，實(shí)驗(yàn)共分8組：對(duì)照組（DMSO），0.6 ug/ml BDE-209組，1.0 ug/ml BDE-209組，6.0 ug/ml BDE-209組，3.2ug/ml BDE-47組，0.6ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組，1.0ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組，6.0ug/ml BDE-209+3.2ug/ml BDE-47組

16、，每組設(shè)5個(gè)平行樣。對(duì)照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　4.染毒72h后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)觀察，利用圖象分析軟件記錄形成神經(jīng)球的個(gè)數(shù)，測(cè)量神經(jīng)球的平均直徑。
　　【結(jié)果】
　　1.神經(jīng)干細(xì)胞鑒定：海馬組織經(jīng)培養(yǎng)3～5天可見(jiàn)神經(jīng)球形成,之后可見(jiàn)神經(jīng)球逐漸增大，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記性蛋白巢蛋白(Nestin)表達(dá)陽(yáng)性，證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。
　　2.海馬神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)3

17、～4代后在倒置顯微鏡下觀察，由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞聚集形成大小不等的神經(jīng)球，表面可見(jiàn)單細(xì)胞突出呈魚(yú)泡狀，折光性強(qiáng)，周?chē)鈺灻黠@，吹打成單細(xì)胞懸液后行免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的純度進(jìn)行檢測(cè)。由結(jié)果可見(jiàn)分散的神經(jīng)干細(xì)胞占主體,可占90%以上。
　　3.利用圖象分析軟件記錄形成神經(jīng)球的個(gè)數(shù)，測(cè)量神經(jīng)球的平均直徑，發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-209染毒組(0.6 ug/ml BDE-209組)形成神經(jīng)球個(gè)數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。隨著染毒劑量的增加，神經(jīng)

18、球數(shù)目變少。還發(fā)現(xiàn)低劑量BDE-209染毒組(0.6 ug/ml BDE-209組和1.0 ug/ml BDE-209)形成神經(jīng)球直徑大小與對(duì)照組無(wú)顯著差異。BDE-209和BDE-47聯(lián)合染毒對(duì)形成神經(jīng)球個(gè)數(shù)的影響存在交互作用(P<0．05)。
　　【結(jié)論】
　　以上提示：無(wú)血清培養(yǎng)的新生鼠海馬組織神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和增殖能力，神經(jīng)干細(xì)胞形成懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定所培養(yǎng)的是神經(jīng)干細(xì)胞。一定劑量的BDE-2

19、09和BDE-47可導(dǎo)致新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞形成神經(jīng)球數(shù)目及直徑改變，BDE-209與BDE-47之間對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)存在一定的交互作用。
　　第二部分低劑量BDE-209單獨(dú)和與BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞蛋白組學(xué)的影響
　　【目的】
　　采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究BDE-209及BDE-47對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞蛋白的影響，從蛋白質(zhì)水平探討PBDES神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制。
　　【材料與方法】
　　1.傳代培養(yǎng)3

20、-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞暴露于BDE-209及BDE-47，實(shí)驗(yàn)共分4組：（1）對(duì)照組（DMSO）；（2）6.0 ug/ml BDE-209組；（3）3.2 ug/mlBDE-47組；（4）6.0 ug/ml BDE-209+3.2 ug/mlBDE-47組。每組設(shè)5個(gè)平行樣。對(duì)照組加入含1‰DMSO的培養(yǎng)液。
　　2.染毒培養(yǎng)72h后，離心收集細(xì)胞，提取各組總蛋白質(zhì)，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)樣品濃度。
　　3.

21、進(jìn)行雙向凝膠電泳（2-DE）分離差異蛋白：第一向等電聚焦（IEF）；第二向SDS-PAGE.
　　4.凝膠染色：分析膠銀染，質(zhì)譜膠考染。
　　5.銀染后采用Powerlook1100掃描儀對(duì)染色后的雙向凝膠電泳膠進(jìn)行掃描獲取圖像，采用Image Master2D platinum5.0凝膠圖像分析軟件進(jìn)行分析識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。
　　6.對(duì)表達(dá)差異1.8倍以上蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解和MALDI-TOF-MS檢測(cè)，獲得