新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、目的：(1)建立簡(jiǎn)便、易行的新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并鑒定神經(jīng)干細(xì)胞；(2)探討神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)外增殖、分化的特點(diǎn)，并從局部微環(huán)境角度來(lái)探討神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)生與分化機(jī)制，為細(xì)胞體內(nèi)移植研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)從新生大鼠海馬中分離NSC，采用NSC克隆懸浮法，選用DMEM/F12培養(yǎng)液，添加無(wú)血清培養(yǎng)添加劑B<,27>，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)

2、，機(jī)械和胰酶消化的方法分離連續(xù)傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NSC標(biāo)志物Nestin的表達(dá)及分化后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和2，3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表達(dá)；(2)觀察20ng/ml濃度下的bFGF、EGF對(duì)NSC增殖的影響，用免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞法觀察bFGF，EGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響；(3)采用化學(xué)法

3、、差速貼壁法和振蕩法分離純化星型膠質(zhì)細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法，GFAP標(biāo)記星型膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞純度的鑒定；將星型膠質(zhì)細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞均勻長(zhǎng)滿后，換神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱孵育24h，將涂有PLL的蓋玻片放入6孔板中，將神經(jīng)干細(xì)胞球種到蓋玻片上，在互不接觸的情況共培養(yǎng)，每2d更換一次培養(yǎng)基，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察星型膠質(zhì)細(xì)胞源性因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化后 NSE、GFAP和酪氨酸羥化酶(TH)表達(dá)的影響。 結(jié)

4、果： (1)從新生大鼠海馬分離的細(xì)胞在含有生長(zhǎng)因子bFGF或EGF的無(wú)血清的神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，能形成大量懸浮的神經(jīng)干細(xì)胞球，流式細(xì)胞儀的結(jié)果表明這些干細(xì)胞球可在體外擴(kuò)增及傳代培養(yǎng)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，Nestin抗體標(biāo)記陽(yáng)性，分化后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原；(2)免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞顯示bEGF能明顯增加NSE的表達(dá)(P<0.05)，EGF能明顯增加GFAP的表達(dá)(P<0.05)；(3)

5、純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，GFAP抗體標(biāo)記陽(yáng)性，細(xì)胞純度達(dá)98％；(4)星型膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞貼壁分化加快，經(jīng)免疫組化染色鑒定，NSE陽(yáng)性細(xì)胞及TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：(1)能夠從新生大鼠的海馬中分離出具有能自我更新、具有增殖能力和多分化潛能，表達(dá)Nestin蛋白的干細(xì)胞，該類細(xì)胞屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞，該方法簡(jiǎn)便易行，是進(jìn)行誘導(dǎo)分化的良好細(xì)胞模型；(2)bFGF誘導(dǎo)NSC更