褪黑素對大鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是臨床常見創(chuàng)傷，常導(dǎo)致四肢截癱等嚴(yán)重后果。近年來，脊髓損傷及修復(fù)的有關(guān)研究取得很大進(jìn)展，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)及細(xì)胞移植被認(rèn)為是治療脊髓損傷的希望，是最有前景的方法之一。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹荚谘芯考顾柙葱陨窠?jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)，增殖及定向誘導(dǎo)NSCs 向神經(jīng)元分化，為治療脊髓損傷提供合適的種子細(xì)胞，為進(jìn)一步細(xì)胞移植提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)一胚胎大鼠

2、脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞分離及體外培養(yǎng) 從孕14d 胚胎大鼠的脊髓中分離得到脊髓NSCs,采用無血清法培養(yǎng)并傳代純化.觀察細(xì)胞生長狀況及特性,進(jìn)行神經(jīng)巢蛋白抗原（neuroepithelial stemcell protein，Nestin）鑒定。結(jié)果：分離所得NSCs 具有連續(xù)克隆能力，呈懸浮狀態(tài)生長。在無血清培養(yǎng)條件下，脊髓源性NSCs 快速增殖，48-72h內(nèi)可形成細(xì)胞球（neurosphere），將這些細(xì)胞球吹打分離成單細(xì)胞后

3、重新培養(yǎng)，單個(gè)的細(xì)胞又很快變成細(xì)胞球。免疫組化結(jié)果顯示這些細(xì)胞表達(dá)nestin,證實(shí)為神經(jīng)干細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)二褪黑素對鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化的影響 取生長狀態(tài)良好的脊髓NSCs，加入終濃度為100μmol/L、1μmol/L 及10nmol/L 的褪黑素（melatonin ,MT），采用細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合免疫熒光檢測法，觀察NSCs 的生長增殖及分化狀況。結(jié)果顯示：100μmol/L 的MT 和1μmol/L的MT 均能促

4、進(jìn)脊髓NSCs 增殖；10nmol/L 的MT 則抑制脊髓NSCs 增殖。3種濃度的MT 均能使脊髓NSCs 向神經(jīng)元分化的比率增加[對照組和實(shí)驗(yàn)組的神經(jīng)元分化比率分別為(23.6±2)％，(45.3±1)％，(42.5±2)％，(50.7±2)％] 。結(jié)論：3 種不同濃度的褪黑素對大鼠脊髓NSCs 體外增殖有著不同的作用，但都促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。 實(shí)驗(yàn)三褪黑素與全反式維甲酸聯(lián)合作用對胚胎大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響 在

5、實(shí)驗(yàn)一基礎(chǔ)上，取第4 代純化脊髓NSCs 經(jīng)吹打分離成單細(xì)胞懸液，適當(dāng)密度接種于未包被25cm2 玻璃培養(yǎng)瓶，加入全反式維甲酸（all-transretinoic acid ,ATRA ）與不同濃度的MT 組合．觀察NSCs 分化狀況，細(xì)胞免疫化學(xué)熒光方法進(jìn)行分化細(xì)胞類型鑒定，計(jì)算各組神經(jīng)元分化比例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：與對照組[(8.8±1 )％]比，單純ATRA 作用組神經(jīng)元分化比率[(10.6±2) ％]無明顯差異;單純MT

6、作用組100μmol/L[(24.8±2) ％]與10nmol/L MT[(23.4±1) ％]兩組都能明顯促進(jìn)脊髓NSCs 向神經(jīng)元分化，兩組間比較無明顯差異；ATRA 與100μmol/L MT 共同作用組[(53.9±2)％]，進(jìn)一步提高了脊髓NSCs 向神經(jīng)元分化的比率；ATRA 與10nmol/L MT 共同作用組[(26.7±2)％]也能促進(jìn)脊髓NSCs 向神經(jīng)元方向分化（與對照組相比較），但其分化率與單一使用MT 的兩組比