嗅鞘細(xì)胞體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSCs)是指具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力,能夠自我更新,并提供大量神經(jīng)細(xì)胞的原始細(xì)胞群。近年來,有關(guān)NSCs的研究已成為神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點,因為它既是研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞分化的良好載體,又是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷以及退行性疾病最理想的供體細(xì)胞來源之一。目前,原位誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖分化或NSCs移植已被嘗試用于治療

2、帕金森癥、亨廷頓病、癲癇、腦缺血和中樞創(chuàng)傷等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明,內(nèi)源性NSCs激活或外源性NSCs移植可以明顯緩解疾病的臨床癥狀,并在一定程度上促進(jìn)受損功能的恢復(fù)。 NSCs定向誘導(dǎo)分化為成熟的具有功能的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞是使其能應(yīng)用于臨床治療的關(guān)鍵問題。研究發(fā)現(xiàn),NSCs的分化與其所處微環(huán)境密切相關(guān)。微環(huán)境主要由各種可溶性因子、膜結(jié)合因子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等眾多復(fù)雜的成分所構(gòu)成,這些成分相互影響,相互協(xié)調(diào),通過細(xì)

3、胞間相互作用的方式參與NSCs的分化發(fā)育和功能調(diào)節(jié)。因此,深入的研究微環(huán)境對NSCs分化的調(diào)節(jié)作用,對臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。 近年來,嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植被認(rèn)為是脊髓損傷最有前景的治療方法之一。動物實驗發(fā)現(xiàn),OECs移植可以促進(jìn)大鼠皮質(zhì)脊髓束再生,并促進(jìn)肢體運動功能恢復(fù)。臨床實驗也顯示,人OECs種植于脊髓損傷患者的脊髓中,可以部分改善脊髓功能。研究發(fā)現(xiàn),移

4、植的OECs可以通過多種機制促進(jìn)神經(jīng)再生。移植的OECs通過分泌多種細(xì)胞黏附分子和神經(jīng)營養(yǎng)因子,使脫髓鞘的軸突重新生成髓鞘,為軸突的再生提供一個良好的微環(huán)境；同時形成一個化學(xué)和物理屏障來防止再生軸突與膠質(zhì)瘢痕中的抑制因子接觸,進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)。然而,移植OECs對中樞內(nèi)源性NSCs增殖和分化是否具有影響目前還知之甚少。 本實驗旨在研究OECs對NSCs分化的影響及其可能的作用機制,為研究OECs在CNS損傷修復(fù)中的生物學(xué)機制

5、提供新的線索,同時也為NSCs移植用于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及CNS損傷的臨床治療提供一些新的思路。 在研究中,我們首先從成年新生(24小時內(nèi))GFP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)分離培養(yǎng),鑒定NSCs,然后采用細(xì)胞共培養(yǎng)模型,比較OECs,大腦皮層混合細(xì)胞(CTX),神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(B104 neuroblatoma cells,B104 cells)對NSCs分化的影響,通過觀察細(xì)胞形態(tài),統(tǒng)計分析不同條件下NSCs分化為NG2陽性細(xì)胞和

6、GFAP陽性細(xì)胞的比例,從而對OECs誘導(dǎo)NSCs分化的影響進(jìn)行初步的探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)在含有神經(jīng)營養(yǎng)因子bFGF的生長培養(yǎng)液中,來自新生GFP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層的NSCs迅速分裂增殖,形成懸浮生長的細(xì)胞球。神經(jīng)球免疫熒光染色顯示,神經(jīng)球中幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)NSCs的特異性標(biāo)志Nestin。在撤離神經(jīng)營養(yǎng)因子,并添加N2的條件下,生長在Poly-L-Lysine包被的coverslip上的NSCs可以分化為Tujl陽性的神

7、經(jīng)元、GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞以及NG2陽性的細(xì)胞。 (2)在細(xì)胞共培養(yǎng)模型中,將NSCs與OECs、CTX以及B104共培養(yǎng),在無血清N2培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化7天后,觀察發(fā)現(xiàn)OECs組中,NG2染色陽性細(xì)胞比例明顯低于三個對照組,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。 (3)進(jìn)一步采用OECs條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)和固定細(xì)胞共培養(yǎng)(fixed cell co-culture,Fix)實驗,發(fā)現(xiàn)在無血清培養(yǎng)

8、基N2誘導(dǎo)分化7天后,CM組和固定的OECs與NSCs共培養(yǎng)組中,NG2染色陽性細(xì)胞比例均明顯低于對照組,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。 (4)在細(xì)胞共培養(yǎng)模型中,將NSCs與OECs、CTX以及B104共培養(yǎng),在無血清N2培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化7天后,觀察發(fā)現(xiàn)OECs組中,GFAP染色陽性細(xì)胞比例明顯高于對照組,具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 (5)進(jìn)一步采用OECs條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)和固定細(xì)胞共培養(yǎng)(fi

9、xed cell co-culture,Fix)實驗,在無血清培養(yǎng)基N2誘導(dǎo)分化7天后,觀察發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)組中,GFAP染色陽性細(xì)胞比例明顯高于對照組,具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。而在CM組和Fix cell co-culture組中,GFAP染色陽性細(xì)胞比例與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。 本實驗結(jié)論如下： (1)原代培養(yǎng)新生GFP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細(xì)胞球在體外增殖迅速,Nestin染色陽性,在無血清N2培養(yǎng)基誘導(dǎo)7天后,其分化為神經(jīng)元

10、,星形膠質(zhì)細(xì)胞,NG2陽性細(xì)胞,符合NSCs基本生物學(xué)特征,在本實驗中成功建立了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層NSCs體外原代培養(yǎng)的技術(shù)。 (2)OECs抑制NSCs向NG2陽性細(xì)胞分化,此作用由OECs細(xì)胞表面分子和OECs分泌的可溶性分子參與介導(dǎo)。 (3)OECs促進(jìn)NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化,單獨的OECs細(xì)胞表面分子或OECs分泌的可溶性分子無此作用,說明OECs對NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的影響可能需要OEC