鼠胚神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)及其定向分化的實驗研究.pdf

1、本研究旨在觀察肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對鼠胚神經(jīng)干細胞(neuralstemcell,NSC)體外誘導分化的促進作用，以及檢測內(nèi)源性bHLH基因-MASHl、neuroD、neurogenin2(Ngn2)在神經(jīng)干細胞分化過程中表達的動態(tài)變化，探索神經(jīng)干細胞分化的一些內(nèi)部分子機制。首先取孕14-17天的SD大鼠的胚胎腦組織，在體外分離培養(yǎng)得到神經(jīng)干細胞后，分為兩組，實驗

2、組以HGF、IGF-1、BDNF等作為誘導分化劑誘導其分化，而對照組僅加入胎牛血清(FBS)，以免疫組化的方法鑒定所獲得的神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元(neuron)、星型膠質(zhì)細胞(gliocyte)和少突膠質(zhì)細胞(oligodendrocyte)，以鏡下直接計數(shù)和流式細胞儀的方法來計數(shù)誘導分化的神經(jīng)元比例。選取未分化、分化1天、3天、5天做為觀察和研究的時間段，采用RT-PCR的方法分析分化各個時期內(nèi)源性bHLH基因表達的差異。原代培養(yǎng)結果顯示

3、：在培養(yǎng)基中生長的細胞不斷出現(xiàn)形態(tài)學的改變，4天左右，由一個細胞分裂而來的細胞已經(jīng)長為幾十個細胞聚集在一起的懸浮生長的神經(jīng)克隆球，培養(yǎng)至1周左右時，神經(jīng)球增多、增大，邊緣可見到鋸齒狀的單細胞邊界，形態(tài)規(guī)則，立體感強。誘導分化4-8小時后，兩組在倒置顯微鏡下均可以觀察到部分原來呈懸浮生長的克隆球貼壁，逐漸失去其球狀的立體外觀。24小時后即可發(fā)現(xiàn)從細胞團塊的邊緣向外長出突起，克隆球中的細胞有向外遷移的趨勢，3天后即有不同形態(tài)的細胞從克隆球周

4、圍出現(xiàn)，5天后克隆球已完全附壁。Nestin是神經(jīng)干細胞的特異性抗體，染色陽性說明原代培養(yǎng)所得到的細胞克隆球為神經(jīng)干細胞；MAP-2/NSE、GFAP和Gal-c為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的標志性抗體，染色陽性證明獲得了相應的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。細胞計數(shù)結果表明：誘導分化后，實驗組神經(jīng)元比例可達50-60﹪，而對照組僅為30﹪左右。RT-PCR結果提示：在神經(jīng)干細胞分化的過程中，實驗組與對照組bHLH基因MASH1、neuroD

5、與Ngn2基因表達均高于未分化組，動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，bHLH基因在神經(jīng)干細胞誘導分化1天時表達最強，3天后表達逐漸減弱，且實驗組bHLH基因的表達均強于對照組。上述研究結果表明：本實驗通過體外培養(yǎng)獲得了具有自我更新和多向分化能力的神經(jīng)干細胞；誘導分化后獲得了神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，計數(shù)結果顯示HGF、IGF-1與BDNF均可誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，其中尤以IGF-1的作用最為明顯。BDNF與IGF-1兩者聯(lián)用誘導神經(jīng)干細