神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及分化的相關研究.pdf

1、本課題是關于神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及分化方面的研究。 立題一：低溫保存流產(chǎn)兒脊髓神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng) 為了比較不同來源神經(jīng)干細胞的特性，探尋適合移植治療的神經(jīng)干細胞來源，人們已經(jīng)從除成人脊髓外的人胚和成人各個腦區(qū)分離神經(jīng)干細胞進行研究，這些人體神經(jīng)組織大部分都是新鮮取材立即培養(yǎng)，少部分取材后經(jīng)過營養(yǎng)液中的短暫保存后培養(yǎng)，然而工作中常遇到不能立即取材的情況，因此本立題將14周齡流產(chǎn)兒不經(jīng)任何處理置于冰箱中低溫保存一段時間后，分

2、段進行脊髓神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)，檢測能否分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，并對分離的干細胞的克隆形成能力、分化潛能等性質進行進一步分析比較。 立題二：新生小鼠端腦多能神經(jīng)前體細胞分化成運動神經(jīng)元的研究 神經(jīng)干細胞移植到宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)后的遷移分化情況在很大程度上受移植處微環(huán)境的影響，損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)則對神經(jīng)干細胞的分化更具選擇性作用，植入的神經(jīng)干細胞大多分化成膠質細胞，這也是利用神經(jīng)干細胞進行神經(jīng)修復需要解決的問題。為了使移植的

3、細胞如期分化為神經(jīng)元細胞，人們嘗試了神經(jīng)元前體細胞移植，雖然神經(jīng)元前體細胞在移植后不分化成膠質細胞，但在損傷區(qū)的成熟受到限制，即表達特異類型的神經(jīng)遞質受到限制。因此在移植前把干細胞誘導分化成特定類型的神經(jīng)元更具可行性。運動神經(jīng)元因其在神經(jīng)疾病中的重要性及發(fā)育機制相對清楚，是目前誘導分化研究較多的神經(jīng)元類型。運動神經(jīng)元已經(jīng)證明能夠從胚胎干細胞及胚胎神經(jīng)干細胞誘導分化，本立題探尋新生期小鼠端腦多能神經(jīng)前體細胞是否能夠分化成運動神經(jīng)元，并探尋

4、提高其分化效率的方法，為運動神經(jīng)元誘導分化提供新的細胞來源。 立題三：OMgp對神經(jīng)干細胞分化的影響 神經(jīng)干細胞植入成體非神經(jīng)發(fā)生部位或損傷區(qū)絕大部分分化成膠質細胞，但植入發(fā)育期神經(jīng)組織中能夠分化成神經(jīng)元，目前還不清楚造成這種差異的原因。發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)與成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)別之一在于成體有發(fā)育完好的髓鞘，而且髓鞘是脊髓損傷后抑制軸突再生的主要局部環(huán)境因素之一，那么，前述神經(jīng)干細胞移植后的分化現(xiàn)象是否也與髓鞘有關呢?因

5、此，本立題探討髓鞘的主要活性成份之一OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein)對神經(jīng)干細胞分化是否具有影響，同時探討OMgp對干細胞源性神經(jīng)元軸突生長是否也有的影響，并檢測NGF、dbcAMP(dibutyryl cAMP)對OMgp是否具有對抗作用。 研究材料與方法： 立題一：14周流產(chǎn)兒在4℃下保存，于2 h、6 h和12 h后取脊髓，頸段、胸段、腰骶段分別進行無血清培養(yǎng)，并用

6、胎牛血清誘導分化。用克隆培養(yǎng)的方法驗證培養(yǎng)細胞的干細胞特性。用免疫熒光細胞化學的方法檢測神經(jīng)干細胞標志nestin及干細胞誘導分化后神經(jīng)元標志MAP2、星形膠質細胞標志GFAP、膽堿能標志CkAT，比較不同時間點以及不同部位分離神經(jīng)干細胞的差異。 立題二：取新生小鼠端腦進行多能神經(jīng)前體細胞的分離培養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，8～10天后用5％胎牛血清誘導分化，并用RA(retinoic acid)、Shh(sonichedgehog

7、)以及dbeAMP來提高運動神經(jīng)元的分化效率，利用免疫熒光的方法檢測運動神經(jīng)元標志物MAP2、ChAT及HB9來證明運動神經(jīng)元的分化；利用神經(jīng)前體細胞與骨骼肌共同培養(yǎng)，通過免疫熒光方法檢測MAP2、N-AChR共存來證明分化運動神經(jīng)元與肌細胞能夠形成突觸結構，并運用藥理學方法證明突觸能夠傳遞沖動。 立題三：取新生小鼠端腦進行神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)，用5％胎牛血清誘導分化，并將其分為四組：將分化培養(yǎng)分成4個組，組1為陰性對照，組2加

8、入終濃度為50ng/ml OMgp，組3加入終濃度為50ng/ml OMgp+100 ng/ml NGF，組4加入終濃度為50 ng/ml OMgp+1000μMdbcAMP，培養(yǎng)4天后用免疫熒光的方法檢測神經(jīng)干細胞分化后神經(jīng)元標志MAP2、星形膠質細胞標志GFAP，并計算并比較各組神經(jīng)元與膠質細胞的比例，測量并比較各組神經(jīng)元軸突的長度。 實驗結果： 立題一：在各個時間點上，頸段、胸段、腰骶段脊髓均分離培養(yǎng)出具有連續(xù)增殖

9、能力的神經(jīng)球，腰骶段分離出的神經(jīng)球數(shù)量最多，12h組各段分離出的神經(jīng)球較2 h、6h組顯著減少。各培養(yǎng)中神經(jīng)球均為nestin陽性，誘導分化后均能夠產(chǎn)生GFAP陽性星形膠質細胞、MAP2陽性神經(jīng)元以及ChAT陽性的膽堿能神經(jīng)元。各培養(yǎng)中神經(jīng)干細胞的克隆形成能力相似。 立題二：從新生小鼠端腦成功分離培養(yǎng)多能神經(jīng)前體細胞，具有連續(xù)增殖能力，能分化形成MAP2陽性神經(jīng)元以及GFAP陽性星形膠質細胞，4％的分化細胞為ChAT<'+>的膽

10、堿能神經(jīng)元，1％的細胞表達運動神經(jīng)元特異性標志物HB9，當加入運動神經(jīng)元誘導因子后，HB9<'+>細胞數(shù)增加到5％。神經(jīng)前體細胞與骨骼肌細胞共培養(yǎng)時可見分化的運動神經(jīng)元與骨骼肌形成突觸結構，并能夠傳導沖動。 立題三：神經(jīng)干細胞正常分化培養(yǎng)中MAP2陽性神經(jīng)元比例13.85％，GFAP陽性星形膠質細胞比例3.15％，加入OMgp后神經(jīng)元比例降至3.40％，星形膠質細胞比例升至6.01％，同時軸突生長受抑；NGF和dbcAMP對OM

11、gp有拮抗作用。 研究討論： 立題一：克隆培養(yǎng)證明本研究中分離的細胞能夠自我更新、擴增，能夠分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細胞，符合干細胞的評定標準。腰骶段能夠分離更多的神經(jīng)球說明腰骶段有更多有反應能力的干細胞或腰骶段的干細胞有更強的存活能力。隨流產(chǎn)兒體外保存時間的延長，分離的神經(jīng)球數(shù)量減少，說明干細胞死亡逐漸增加。脊髓各節(jié)段分離的細胞具有相似的克隆形成能力及分化能力，本質上可認為是同種細胞。 立題二：從新生小鼠端腦分

12、離細胞具有連續(xù)增殖能力，能分化形成神經(jīng)元以及星形膠質細胞符合多能神經(jīng)前體細胞評定標準。部分分化細胞表達運動神經(jīng)元特異性分子標志HB9說明分化培養(yǎng)中有運動神經(jīng)元的產(chǎn)生。分化的運動神經(jīng)元能與骨骼肌細胞形成突觸并傳導沖動，說明這些運動神經(jīng)元具有功能性。 立題三：OMgp促神經(jīng)干細胞向星形膠質細胞方向分化，抑制神經(jīng)元方向的分化；NGF對其有對抗作用；dbcAMP也具對抗作用提示OMgp發(fā)揮作用可能通過NgR通路。 研究結論：