熱預(yù)處理后嗅鞘細胞上清液誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元定向分化的研究.pdf

1、目的:近年來大量研究證實嗅鞘細胞(olfactoryensheathingcells，OECs)與神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)聯(lián)合移植治療中樞神經(jīng)損傷具有顯著療效。但細胞移植后，NSCs向神經(jīng)元分化效率低是制約細胞移植療效的因素之一。本實驗擬在體外運用熱預(yù)處理的方法提高OECs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化比例，并探討對OECs熱預(yù)處理促進NSCs向神經(jīng)元分化的機制。
　　方法:新生3d昆明小鼠，提取

2、嗅球，分離、培養(yǎng)嗅鞘細胞并鑒定，再將純化的OECs分為3組。37OEC組:無血清條件培養(yǎng)基下OECs置于37℃培養(yǎng)48h;40OEC組:無血清條件培養(yǎng)基下OECs置于40℃培養(yǎng)箱預(yù)處理6h，再置于37℃培養(yǎng)42h;40OEC+R組:在OECs無血清條件培養(yǎng)基里加入20μM低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)抑制劑(YC-1)，于40℃培養(yǎng)箱預(yù)處理6h，再置于37℃培養(yǎng)42h。MTT法檢測預(yù)處理后OECs細胞活力。收集各組OEC上清液(OC

3、M)，標記為37OCM，40OCM,40OCM+R。取P3代小鼠神經(jīng)干細胞系C17.2細胞，培養(yǎng)至80％細胞融合，清除含血清培養(yǎng)基后分別加入三組OEC上清液，通過免疫熒光計數(shù)、Western-blot方法檢測C17.2NSCs向神經(jīng)元分化比例情況，并用RT-PCR、Western-blot和ELISA方法分別檢測OECs及OCM中HIF-1α及其靶基因EPO、VEGF表達。
　　結(jié)果:MTT細胞活力檢測示3組OECs的細胞活力無顯

4、著差異。NSCs在加入37OCM組、40OCM組和40OCM+R組上清液誘導(dǎo)后，通過免疫熒光計數(shù)發(fā)現(xiàn)，40OCM組中分化細胞神經(jīng)元標志物β微管蛋白(β-tublinⅢ，Tuj-1)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associatedprotein2，MAP-2)陽性細胞數(shù)目(31.40±1.08％、31.80±1.60％)顯著高于37OCM組(23.60±1.36％、22.80±1.66％)和40OCM+R組(22.60±1.

5、50％、24.00±2.30％)，37OCM與40OCM+R兩組之間Tuj-1、MAP-2陽性細胞數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異。Western-blot也證實，在40OCM誘導(dǎo)組中，Tuj-1蛋白表達顯著高于37OCM組和40OCM+R組，而37OCM和40OCM+R兩組之間Tuj-1、MAP-2蛋白表達無顯著差異。RT-PCR結(jié)果示40OEC組HIF-1α及其下游靶基因EPO、VEGF轉(zhuǎn)錄水平較37OEC、40OEC+R組明顯增高;Western

6、blot結(jié)果提示40OEC組HIF-1α蛋白表達含量顯著高于37OEC、40OEC+R組;Elisa檢測發(fā)現(xiàn)40OCM組中EPO、VEGF含量顯著高于37OCM、40OCM+R組。
　　結(jié)論:OECs經(jīng)熱預(yù)處理后，其上清液能更有效的誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元定向分化，提高其分化比例。熱預(yù)處理后HIF-1α表達上調(diào)是促進NSCs向神經(jīng)元定向分化的重要因素，HIF-1α下游靶基因EPO、VEGF激活和表達可能是提高NSCs向神經(jīng)元分化比例的