骨髓間質干細胞定向誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細胞的體外研究.pdf

1、[目的]
　　 體外將骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell，BMSCs)誘導分化為特殊組織類型的多巴胺能神經(jīng)元，研究BMSCs在分化過程中細胞形態(tài)的實時改變以及細胞膜特異性抗原的陽性表達率，并對誘導后細胞間所形成的連接進行形態(tài)和功能的檢測；探討體外誘導BMSCs為特殊組織學類型神經(jīng)元的可行性，并比較BMSCs誘導為多巴胺能神經(jīng)元和未誘導為多巴胺能神經(jīng)元之間的差異性。
　　

2、[方法]
　　 將提取的大鼠BMSCs在體外擴增、傳代并用流式細胞儀對其進行細胞表面抗原的鑒定后，將BMSCs按如下方案進行分組誘導：實驗組Ⅰ(僅加入bFGF+GDNF誘導)；實驗組Ⅱ(除bFGF+GDNF外另加入特異性誘導劑WHI-P131和shh)；對照組(不加入任何誘導劑)。觀察各組細胞形態(tài)變化、測量并比較細胞突起數(shù)量和長度，了解誘導后各組細胞形態(tài)變化的差異；檢測誘導后各組細胞神經(jīng)元特異性表面抗原陽性率；逐日監(jiān)測各組細胞上

3、清中多巴胺含量并進行多巴胺能神經(jīng)元特異性抗原(DAT、TH)的免疫組化染色，鑒定后統(tǒng)計多巴胺能神經(jīng)元的比例；MTT法繪制各組細胞生長曲線圖，了解并比較各組細胞的生長情況；采用細胞免疫組化法顯示突觸后致密蛋白95(PSD-95)的表達，觀察各組細胞是否有成熟突觸結構的形成；利用熒光染料FM1-43進行突觸小泡的染色，間接觀察分化后各組細胞突觸循環(huán)的效能。
　　 [結果]
　　 1、BMSCs體外擴增、傳代至第3代后，流式細

4、胞儀檢測到表達BMSCs的重要標志物CD29、CD44陽性細胞比率為99.76％和93.60％。
　　 2、兩個實驗組不論是否加入特異性誘導劑WHI-P131和shh，免疫組化顯示誘導后的細胞表達神經(jīng)元特異性標志蛋白的Nestin和NSE的陽性率高達60％～80％，而星形膠質細胞的特異性標志物GFAP為10％左右。
　　 3、加入了特異性誘導劑WHI-P131和shh的實驗組Ⅱ的細胞經(jīng)過免疫組化染色證實多巴胺能神經(jīng)元特異

5、性表面抗原DAT(多巴胺轉運蛋白)和TH(酪氨酸羥化酶)分別為(82.90±2.0)％和(84.02±1.6)％，且于誘導后細胞培養(yǎng)上清液中檢測到多巴胺的分泌。未加入特異性誘導劑的實驗組Ⅰ則上述變化不明顯。
　　 4、通過對各組各個時間點的MTT檢測并繪制生長曲線后顯示，兩個誘導組的細胞的存活率均高于空白對照組，但兩實驗組之間細胞存活率差異無明顯統(tǒng)計學意義。
　　 5、BMSCs誘導為多巴胺能神經(jīng)元樣細胞后細胞突起數(shù)量、

6、長度以及PSD-95的免疫組化陽性率和FM1-43染色后熒光密度均高于未加入特異性誘導劑組。
　　 [結論]
　　 1、BMSCs在體外可以誘導為純度較高的多巴胺能神經(jīng)元樣細胞。
　　 2、BMSCs誘導為多巴胺能神經(jīng)元樣細胞后在神經(jīng)元特異性表面標志物(Nestin、NSE、GFAP)陽性率、誘導分化率、細胞存活率上無明顯改變。
　　 3、BMSCs誘導為多巴胺能神經(jīng)元樣細胞樣細胞后，在細胞突起數(shù)量、長度