骨髓間質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞的體外研究.pdf

1、[目的]
　　 體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell，BMSCs)誘導(dǎo)分化為特殊組織類型的多巴胺能神經(jīng)元，研究BMSCs在分化過程中細(xì)胞形態(tài)的實(shí)時(shí)改變以及細(xì)胞膜特異性抗原的陽(yáng)性表達(dá)率，并對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞間所形成的連接進(jìn)行形態(tài)和功能的檢測(cè)；探討體外誘導(dǎo)BMSCs為特殊組織學(xué)類型神經(jīng)元的可行性，并比較BMSCs誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元和未誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元之間的差異性。
　　

2、[方法]
　　 將提取的大鼠BMSCs在體外擴(kuò)增、傳代并用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞表面抗原的鑒定后，將BMSCs按如下方案進(jìn)行分組誘導(dǎo)：實(shí)驗(yàn)組Ⅰ(僅加入bFGF+GDNF誘導(dǎo))；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(除bFGF+GDNF外另加入特異性誘導(dǎo)劑WHI-P131和shh)；對(duì)照組(不加入任何誘導(dǎo)劑)。觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化、測(cè)量并比較細(xì)胞突起數(shù)量和長(zhǎng)度，了解誘導(dǎo)后各組細(xì)胞形態(tài)變化的差異；檢測(cè)誘導(dǎo)后各組細(xì)胞神經(jīng)元特異性表面抗原陽(yáng)性率；逐日監(jiān)測(cè)各組細(xì)胞上

3、清中多巴胺含量并進(jìn)行多巴胺能神經(jīng)元特異性抗原(DAT、TH)的免疫組化染色，鑒定后統(tǒng)計(jì)多巴胺能神經(jīng)元的比例；MTT法繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，了解并比較各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；采用細(xì)胞免疫組化法顯示突觸后致密蛋白95(PSD-95)的表達(dá)，觀察各組細(xì)胞是否有成熟突觸結(jié)構(gòu)的形成；利用熒光染料FM1-43進(jìn)行突觸小泡的染色，間接觀察分化后各組細(xì)胞突觸循環(huán)的效能。
　　 [結(jié)果]
　　 1、BMSCs體外擴(kuò)增、傳代至第3代后，流式細(xì)

4、胞儀檢測(cè)到表達(dá)BMSCs的重要標(biāo)志物CD29、CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率為99.76％和93.60％。
　　 2、兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組不論是否加入特異性誘導(dǎo)劑WHI-P131和shh，免疫組化顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白的Nestin和NSE的陽(yáng)性率高達(dá)60％～80％，而星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物GFAP為10％左右。
　　 3、加入了特異性誘導(dǎo)劑WHI-P131和shh的實(shí)驗(yàn)組Ⅱ的細(xì)胞經(jīng)過免疫組化染色證實(shí)多巴胺能神經(jīng)元特異

5、性表面抗原DAT(多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和TH(酪氨酸羥化酶)分別為(82.90±2.0)％和(84.02±1.6)％，且于誘導(dǎo)后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到多巴胺的分泌。未加入特異性誘導(dǎo)劑的實(shí)驗(yàn)組Ⅰ則上述變化不明顯。
　　 4、通過對(duì)各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MTT檢測(cè)并繪制生長(zhǎng)曲線后顯示，兩個(gè)誘導(dǎo)組的細(xì)胞的存活率均高于空白對(duì)照組，但兩實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞存活率差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、BMSCs誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞后細(xì)胞突起數(shù)量、

6、長(zhǎng)度以及PSD-95的免疫組化陽(yáng)性率和FM1-43染色后熒光密度均高于未加入特異性誘導(dǎo)劑組。
　　 [結(jié)論]
　　 1、BMSCs在體外可以誘導(dǎo)為純度較高的多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 2、BMSCs誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞后在神經(jīng)元特異性表面標(biāo)志物(Nestin、NSE、GFAP)陽(yáng)性率、誘導(dǎo)分化率、細(xì)胞存活率上無(wú)明顯改變。
　　 3、BMSCs誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元樣細(xì)胞樣細(xì)胞后，在細(xì)胞突起數(shù)量、長(zhǎng)度