視黃酸對(duì)新生大鼠紋狀體神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景 近年來，微量營(yíng)養(yǎng)素VitA在體內(nèi)的重要生理代謝產(chǎn)物視黃酸(retinoicacid，RA)多種核受體的發(fā)現(xiàn)和鑒定，對(duì)研究VitA類物質(zhì)廣泛的生理功能及其作用機(jī)制意義重大。在哺乳動(dòng)物的大腦生長(zhǎng)發(fā)育過程，視黃酸信號(hào)系統(tǒng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞增殖抑制和終末分化中起關(guān)鍵作用，從而RA亦被認(rèn)為是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素。CNS發(fā)育過程中，紋狀體內(nèi)視黃醇結(jié)合蛋白、視黃酸結(jié)合蛋白、視黃酸核受體(RARs)的特異表達(dá)模式和RA的存在，提示RA

2、在出生后及成年哺乳動(dòng)物紋狀體中基因調(diào)節(jié)的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)因子，RA可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞上神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的表達(dá)，并且與NSCs的分化調(diào)控有關(guān)。因此，該課題研究RA對(duì)NSCs增殖和分化的影響，探討RA定向誘導(dǎo)NSCs分化的作用機(jī)制。 RA通過與細(xì)胞核內(nèi)特異受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)作用，大量的靶基因已被確定，其中某些靶基因就是RARs本身。RARs作為核內(nèi)受體具有與染色體DNA結(jié)合和調(diào)控基因

3、表達(dá)的功能，當(dāng)RARs結(jié)合了RA而被活化后可對(duì)一系列受其調(diào)控的靶基因產(chǎn)生“扳機(jī)”效應(yīng)，對(duì)RARs的功能分析需要對(duì)其進(jìn)行靶基因的鑒定。有研究指出，神經(jīng)細(xì)胞分化早期的一個(gè)變化是細(xì)胞周期蛋白表達(dá)變化，細(xì)胞退出細(xì)胞周期。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白不僅調(diào)控細(xì)胞的分裂增殖，也與細(xì)胞分化成熟密切相關(guān)，RA可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白而影響NSCs的分化。有關(guān)RA與受體結(jié)合后對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控，尤其是對(duì)與神經(jīng)細(xì)胞分化有關(guān)的基因研究甚少。有研究顯示，POU轉(zhuǎn)錄因子家

4、族控制CNS干細(xì)胞特異基因的表達(dá)，nestin和B-FABP基因在CNS的表達(dá)依靠POU結(jié)合位點(diǎn)，POU蛋白聯(lián)合激素核受體超家族(包括RARs、RXRs等)可對(duì)NSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此，該課題研究NSCs經(jīng)atRA誘導(dǎo)分化后POU轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)基因變化，希望對(duì)了解atRA定向誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元的分子機(jī)制有所幫助。 目的 1.建立體外培養(yǎng)的NSCs細(xì)胞模型，為在體外研究NSCs的生長(zhǎng)特性及其分化規(guī)律提供健康的細(xì)

5、胞來源；明確RA對(duì)NSCs增殖、分化以及凋亡的影響，篩選RA在定向誘導(dǎo)NSCs分化時(shí)的適宜作用劑量和時(shí)間。 2.研究NSCs上RARs的表達(dá)情況，明確RA誘導(dǎo)NSCs分化過程中，主要通過何種受體途徑。 3.研究RA誘導(dǎo)NSCs分化過程中，對(duì)細(xì)胞周期及相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)影響，尋找RA在誘導(dǎo)NSCs分化過程中與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的靶基因及其調(diào)節(jié)方式。 4.研究RA在誘導(dǎo)NSCs分化過程，對(duì)與NSCs定向分化的

6、相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)的影響，探索atRA定向誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化的分子機(jī)制。 研究方法 1.通過機(jī)械分離法獲得新生大鼠紋狀體細(xì)胞，利用無血清培養(yǎng)液中bFGF的選擇培養(yǎng)作用以及連續(xù)傳代純化和培養(yǎng)NSCs，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)建立細(xì)胞模型。 2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)分離培養(yǎng)之NSCs及其誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。 3.熒光顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)、PI染色后FCM技術(shù)，分別觀察了atRA

7、對(duì)NSCs的生長(zhǎng)曲線以及誘導(dǎo)NSCs分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞分化率的影響，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期進(jìn)程的變化。 4.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)atRA作用后，NSCs上RARs表達(dá)及變化，細(xì)胞周期調(diào)控因子p53、c-myc基因表達(dá)以及POU家族中Brn-4、Brn-3a基因表達(dá)的變化； 5.Western-Blotting方法檢測(cè)atRA對(duì)NSCs內(nèi)影響細(xì)胞周期的調(diào)控因子c-myc轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平的影響。 結(jié)果 1.通

8、過機(jī)械分離并結(jié)合選擇性培養(yǎng)基等進(jìn)行新生大鼠紋狀體NSCs的分離培養(yǎng)并獲得成功，為體外研究NSCs的生長(zhǎng)特性及其分化規(guī)律提供了一個(gè)適宜的細(xì)胞模型和健康的細(xì)胞來源。 2.不同濃度的atRA對(duì)NSCs細(xì)胞增殖的影響不同(F=25.632,p=0.000)，atRA濃度為0.01μmol/L時(shí)不影響NSCs的生長(zhǎng)(P=0.813)，當(dāng)濃度增加到0.1μmol/L時(shí)，即可抑制NSCs的增殖(p=0.042)，并且隨著atRA濃度的增加，抑

9、制作用越明顯，呈劑量依賴趨勢(shì)。這種抑制增殖作用主要表現(xiàn)細(xì)胞增殖潛伏期延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞倍增延長(zhǎng)。atRA誘導(dǎo)NSCs細(xì)胞凋亡的作用與atRA劑量有關(guān)(F=20.462,p=0.000)，當(dāng)atRA濃度達(dá)到10.0μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到13.7％，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。 3.atRA誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化，其作用在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間、劑量依賴性(F=358.59,p=0.000)，生理濃

10、度(1.0μmol/L)的atRA是誘導(dǎo)NSCs分化的適宜劑量。atRA誘導(dǎo)不同代NSCs分化為NSE陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.255,p=0.292)。表明atRA有特異性誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化的作用。 4.利用RT-PCR技術(shù)，證實(shí)NSCs上存在RARα、RARβ，RARβ基因的表達(dá)對(duì)atRA存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性(F=175.984,p=0.000；F=67.930,p=0.000)，生理濃

11、度(1.0μmol/L)的atRA可顯著提高RARβmRNA表達(dá)水平(P=0.000)。提示atRA可通過調(diào)控RARβmRNA水平的途徑實(shí)現(xiàn)其誘導(dǎo)NSCs分化的作用。 5.細(xì)胞周期分析表明，與正常對(duì)照組相比，生理濃度(1.0μmol/L)的atRA對(duì)NSCs細(xì)胞周期有影響，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞增多(F=36.566,p=0.000)，S期和G2/M期細(xì)胞減少(F=35.982,p=0.000)，細(xì)胞增殖指數(shù)降低(F=36.193,p

12、=0.000)。在atRA誘導(dǎo)NSCs分化過程中，與對(duì)照組相比，atRA處理組p53mRNA的表達(dá)持續(xù)上調(diào)(F=10.044，p=0.002)，在第5d達(dá)到高峰，同時(shí)，atRA處理組c-mycmRNA的表達(dá)下調(diào)(F=20.891,p=0.000)，且c-myc蛋白表達(dá)亦下調(diào)(F=43.138,p=0.000)。提示atRA在誘導(dǎo)NSCs分化過程中，可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及細(xì)胞周期調(diào)控因子而影響NSCs的增殖分化。 6.bFGF反

13、應(yīng)性NSCs上Brn-4基因表達(dá)水平低，在誘導(dǎo)分化條件下，atRA處理組和對(duì)照組Brn-4mRNA表達(dá)均增加，但在誘導(dǎo)分化的第1-5d，atRA處理組Brn-4mRNA表達(dá)明顯較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。利用RARs受體拮抗劑阻斷atRA的作用后，阻斷組Brn-4基因表達(dá)較未阻斷組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。在誘導(dǎo)分化條件下，atRA處理組和對(duì)照組均可表達(dá)Brn-3a基因，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.352

14、,p=0.837)。表明atRA誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化的作用可能通過上調(diào)Brn-4基因的表達(dá)，具體路徑尚需進(jìn)一步研究。 結(jié)論 1.利用機(jī)械分離法進(jìn)行新生大鼠紋狀體NSCs的分離培養(yǎng)并獲得成功。RA有抑制NSCs增殖的作用。RA誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化，其作用在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間、劑量依賴性，誘導(dǎo)劑量以其生理濃度1.0μmol/L較為適宜。 2.RARβ基因的表達(dá)對(duì)atRA存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性。atRA可