銀杏內(nèi)酯B對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)是康復(fù)醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害性疾病中，腦血管疾病的比例當(dāng)居首位，其次為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、顱腦和脊髓損傷等。各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷雖病因各異，但病理上均有中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位、不同程度的神經(jīng)元缺失和結(jié)構(gòu)功能異常。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)廣泛存在的具有自我更新、自我增殖能力和多種分化潛能的特殊

2、細(xì)胞群。神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注，可達(dá)到修復(fù)神經(jīng)通路以及重建神經(jīng)功能的目的，為臨床實(shí)踐帶來(lái)了希望。 目前認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的機(jī)制十分復(fù)雜，受到正性和負(fù)性調(diào)節(jié)分子的調(diào)控。各種調(diào)控NSCs命運(yùn)的信號(hào)分子是相互協(xié)同和依賴(lài)的，NSCs所具有的內(nèi)在分化程序、局部環(huán)境中的細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)、黏附分子、細(xì)胞間的相互作用等均與其增殖、分化密切關(guān)系。細(xì)胞因子的效應(yīng)又受多種因子的調(diào)節(jié)，包括SOCS(Su

3、ppressors of cytokine signaling，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子)家族。 Id(lnhibitor of DNA Binding，DNA結(jié)合抑制因子)作為bHLH(Helix-loop-helix，堿性螺旋-環(huán)-螺旋)轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)性調(diào)節(jié)子而起作用。Id2是Id家族成員之一，原位雜交顯示在腦和脊髓有廣泛表達(dá)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著重要的功能，通過(guò)阻滯bHLH轉(zhuǎn)錄因子作用，抑制NSCs向神經(jīng)元分化。SOCS是近年來(lái)

4、發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)可被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素，并對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)通路具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用的蛋白分子。SOCS2是SOCS家族成員之一，SOCS2 mRNA在發(fā)育和成年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，主要限定在神經(jīng)元中表達(dá)。研究表明SOCS2是一種潛在的神經(jīng)分化調(diào)控因子，在控制神經(jīng)細(xì)胞分化和決定細(xì)胞命運(yùn)方面起重要作用，能促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化，促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能均具有重要作用。 目前國(guó)內(nèi)外神經(jīng)

5、干細(xì)胞的增殖及定向分化研究，多關(guān)注細(xì)胞因子對(duì)NSCs的影響。中醫(yī)藥是我國(guó)的“國(guó)粹”，在神經(jīng)康復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中具有巨大潛力。因此應(yīng)用中藥誘導(dǎo)NSCs的增殖和分化，促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)功能的修復(fù)與重建，可望為中藥治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷開(kāi)辟重要的治療途徑。但中醫(yī)藥對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的研究多局限于現(xiàn)象觀察，缺乏深入的機(jī)制研究。銀杏(Ginkgo bilobo)是一古老而神奇的植物，有“活化石”之稱(chēng)。銀杏萜內(nèi)酯為銀杏葉提取物(EGb，

6、extract of ginkgo bilobo)的主要有效成分，其中銀杏內(nèi)酯B(GKB，Ginkgolide B)含量最多，且抗人體血小板活化因子(PAF)作用最為強(qiáng)大。有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生，GKB具有促進(jìn)NSCs分化的作用，但其作用機(jī)制仍不清楚，進(jìn)一步闡明其調(diào)控機(jī)制對(duì)中醫(yī)藥在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域深層次研究開(kāi)辟思路。 目的：探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制，為GKB應(yīng)用于神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用

7、提供一定的基礎(chǔ)。 方法：從SD大鼠胎鼠SVZa(Anterior subventricularzone，室管膜前下區(qū))分離和培養(yǎng)NSCs。在加入5％胎牛血清(FBS)和不同濃度GKB的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h、12h、24h、3d和7d，用倒置相差顯微鏡測(cè)量分化細(xì)胞突起數(shù)目、突起長(zhǎng)度和胞體面積，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)其微管相關(guān)蛋白(β-Tubulin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(CC-1)的表達(dá)，

8、并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞因子SOCS2、轉(zhuǎn)錄因子Id2的表達(dá)，計(jì)算SOCS2、Id2陽(yáng)性細(xì)胞百分率、SOCS2、Id2免疫反應(yīng)物的平均光密度值。 結(jié)果： 1.NSCs培養(yǎng)、鑒定。從SD大鼠胎鼠SVZa成功分離和培養(yǎng)NSCs，傳代后Nestin染色陽(yáng)性鑒定。 2.銀杏內(nèi)酯B組分化細(xì)胞的神經(jīng)突起數(shù)目增多、長(zhǎng)度增長(zhǎng)、胞體面積增大。在相同時(shí)相點(diǎn)(24h或3d、7d)，20mg/L、40mg/L、60mg/L

9、GKB組神經(jīng)突起數(shù)目、平均長(zhǎng)度、胞體面積與對(duì)照組比較均有顯著差異(P<0.01)；40mg/L、60mg/L GKB組神經(jīng)突起數(shù)目、突起長(zhǎng)度、胞體面積與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/LGKB組與60mg/L GKB組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。在不同時(shí)相點(diǎn)組間比較(24h和3d)，在突起長(zhǎng)度方面，各GKB組和對(duì)照組3d突起長(zhǎng)度與24h突起長(zhǎng)度比較均有顯著差異(P<0.01)；在突起數(shù)目方面，對(duì)照組

10、3d突起數(shù)目比24h突起數(shù)目有所增加，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，而各GKB組3d突起數(shù)目比24h突起數(shù)目比較有顯著差異(P<0.01)， 3.銀杏內(nèi)酯B組β-Tubulin陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞百分率增加，GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)樣細(xì)胞百分率隨GKB濃度的增加而增加，CC-1陽(yáng)性少突膠質(zhì)樣細(xì)胞百分率無(wú)明顯變化。在相同時(shí)相點(diǎn)(3d、7d)，20mg/L、40mg/L、60mg/L GKB組β-Tubulin陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞百分率較對(duì)照組

11、明顯升高(P<0.01)，40mg/L GKB組、60mg/L GKB組β-Tubulin陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞百分率與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/L GKB組與60mg/L GKB組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；20mg/L、40mg/L、60mg/LGKB組GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)樣細(xì)胞百分率與對(duì)照組比較有明顯升高(P<0.01)，各GKB組組間比較均有顯著差異(P<0.05-0.01)。各GKB組CC

12、-1陽(yáng)性少突膠質(zhì)樣細(xì)胞百分率與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 4.銀杏內(nèi)酯B組轉(zhuǎn)錄因子Id2陽(yáng)性細(xì)胞百分率及免疫反應(yīng)物的平均光密度值減少。在時(shí)相點(diǎn)7d，對(duì)照組、20mg/L、40mg/L、60mg/L GKB組Id2陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為66.240/0、57.46％、51.52％、52.0％，Id2免疫反應(yīng)物的平均光密度值分別為5.272、4.457、3.820、3.702。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，20mg/L、40mg/L、60m

13、g/L GKB組Id2陽(yáng)性細(xì)胞百分率和免疫反應(yīng)物的平均光密度值較對(duì)照組顯著減少(P<0.01)；40mg/L、60mg/L GKB組Id2陽(yáng)性細(xì)胞百分率和免疫反應(yīng)物的平均光密度值與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/L GKB組與60mg/L GKB組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 5.銀杏內(nèi)酯B組細(xì)胞因子SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞百分率及免疫反應(yīng)物的平均光密度值增加。在時(shí)相點(diǎn)7d，對(duì)照組、20mg/L、

14、40mg/L、60mg/L GKB組SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為22.17％、30.24％、35.46％、34.72％，SOCS2免疫反應(yīng)物的平均光密度值分別為1.134、1.382、1.578、1.527。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，20mg/L、40mg/L、60mg/L GKB組SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞百分率和免疫反應(yīng)物的平均光密度值與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)；40mg/L、60mg/L GKB組SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞百分率和免疫反應(yīng)物的平均

15、光密度值與20mg/L GKB組比較有顯著差異(P<0.01)，但40mg/L GKB組與60mg/L GKB組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：GKB使分化的神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)突起數(shù)目增多、長(zhǎng)度增長(zhǎng)、胞體面積增大；GKB提高分化細(xì)胞中神經(jīng)元樣細(xì)胞百分率，星形膠質(zhì)樣細(xì)胞百分率與銀杏內(nèi)酯B呈劑量依賴(lài)關(guān)系，對(duì)少突膠質(zhì)樣細(xì)胞百分率則無(wú)明顯影響；GKB增加SOCS2陽(yáng)性細(xì)胞百分率及免疫反應(yīng)物的平均光密度值，減少I(mǎi)d2陽(yáng)性細(xì)胞百分率及免疫